https://hdl.handle.net/10481/31274 2026-04-11T15:51:42Z 2026-04-11T15:51:42Z Suárez, A. https://hdl.handle.net/10481/68742 2021-06-15T16:36:37Z

Construcción de vectores basados en la proteína fluorescente verde para análisis genético en bacterias Suárez, A. El gen gfp que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP) fue utilizado para crear una serie de plásmidos y un minitransposon registradores para el análisis genético. y la monitorización de bacterias. El sistema registrador está integrado en un plásmido para estudio de promotores y en un minitransposon para generar fusiones transcripcionales por inserción al azar en el cromosoma. Con el objeto de mejorar los niveles de sensibilidad necesarios para el uso del sistema en monocopia y para la detección en células individuales, el extremo 3'del gen gfp fue reemplazado por el de otro gen gfp mofidicado que emite luz verde 45 veces más fuerte que la GFP natural. Además, al extremo S' del nuevo gen gfp se fusionó la señal estimuladora de la traducción del gen atpE. La conjugación del minitransposon a dos Pseudomonas spp. diferentes y a Alcaligenes eutrophus produjo fusiones al azar en el cromosoma, de las que un 5% emitían fluorescencia detectable a ojo. La expresión de GFP en células aisladas fue perfectamente visualizada por microscopía de fluorescencia.; The green fluorescent protein (GFP) gene, gfp, was used to develop versatile reporter systems for genetic analysis in, and monitoring of bacteria. The reporter system is available on a plasmid and on a mini-transposon located in a suicide delivery plasmid for generation of chromosomal fusions. To achieve sensitivity levels necessary for use in monocopy and for detection of single cells, the 3'-end of gfp was replaced by that of a modified gfp gene characterized by a 4S-fold stronger signal than that exhibited by the natural OFP, and the modified gfp gene equipped with the strong translation signals of the atpE gene. Transfer of the minitrasnposon into two different Pseudomonas spp. and Alcaligenes eutrophus produced random chromosomal fusions, some 5% of which exhibited fluorescence detectable by eye. Individual OFP+ cells were readily observed by fluorescence microscopy. The detailed map of the step-by-step construction is depicted.

Quijada, L. Soto, M. Requena, J. M. Alonso, C. https://hdl.handle.net/10481/68741 2021-06-15T16:36:38Z

Mecanismos post-transcripcionales en la regulación de la expresión de los genes hsp70 de Leishmania Quijada, L.; Soto, M.; Requena, J. M.; Alonso, C. Los tripanosomátidos representan uno de los grupos de organismos eucariotas más tempranos en la evolución. Durante su larga historia evolutiva, los tripanosomátidos han desarrollado una impresionante variedad de estilos de vida y adaptaciones al parasitismo. El ciclo de vida parasítico de estos organismos está caracterizado por una sucesión de formas diferentes adaptadas a los diferentes ambientes que encuentran en sus hospedadores mamíferos e insectos vectores. Tal vez como reflejo de su origen ancestral, estos organismos poseen una variedad de mecanismos moleculares inusuales implicados en la regulación de la expresión génica. En este contexto, una característica general de la expresión génica en estos parásitos protozoos es la fuerte regulación a nivel post-transcripcional que presentan. En este trabajo se discuten algunos avances recientes implicados en la comprensión de la expresión génica en tripanosomátidos y su regulación.; Trypanosomatids represent one of the earlier groups of eukaryotic organisms in evolution. During their long evolutionary history, the trypanosomatids have developed an impressive variety of life styles and adaptations to parasitism. The parasitic cycle of these organisms is characterized by a succesion of different forms adapted to the different environments they encounter in their mammalian hosts and insect vectors. Perhaps as a reflection of their ancient origin, these organisms posses a variety of unusual molecular mechanisms that result in regulated gene expression. In this context, a general feature of gene expression in these protozoan parasites is its high regulation at post-transcriptional level. In this work, some recent advances in understanding the mechanisms of gene express ion in trypanosomatids and its regulation are discussed.

Alonso, C. Jiménez Ruiz, A. Boceta, C. https://hdl.handle.net/10481/68740 2021-06-15T16:36:32Z

El antígeno de superficie PSA de Leishmania infantum: un nuevo miembro de la familia de proteínas con repeticiones ricas en leucinas Alonso, C.; Jiménez Ruiz, A.; Boceta, C. El antígeno PSA de Leishmania infantum presenta una elevada homología en su estructura primaria con los antígenos PSA-2 de Leishmania major y GP461M2 de Leishmania amazonensis. El análisis de su secuencia de aminoácidos indica que el 60% de la molécula está constituida por 13 motivos repetidos con una longitud que oscila entre los 24 y 25 residuos. La secuencia consenso obtenida para estos motivos concuerda con la secuencia consenso descrita para los motivos repetidos ricos en leucinas, por lo que tanto la PSA de L. infantum como la PSA-2 de L. major y la GP461 M2 de L. amazonensis pueden ser clasificados como nuevos miembros de la familia de proteínas con repeticiones ricas en leucinas. La proteína recombinante y especialmente sus fragmentos expresados de forma independiente son reconocidos eficazmente por sueros obtenidos a partir de perros infectados por el parásito y de pacientes humanos con leishmaniasis.; The primary structure of the PSA antigen from Leishmania infantum shows a high homology with Leishmania major PSA-2 antigen and Leishmania amazonensis GP46/M2 antigen. Aminoacid sequence anaIysis indicates that 60% of the molecule is formed by 13 repeated motives 24-25 aminoacids in length. The consensus sequence derived from these motives shows a highly significant homology with the consensus sequence described for leucine rich repeats, which indicates that L. infantum PSA, L. major PSA-2 and L. amazonensis GP46/M2 may be included into the newly described family of leucine rich repeat containing proteins. The expressed recombinant protein and severa!. fragments expressed individually are efficiently recognized by sera from L. infantum naturally infected dogs and leishmaniasic human patients.

Carrillo, G. Alonso, C. Morales, G. https://hdl.handle.net/10481/68739 2021-06-15T16:36:40Z

Antigenicidad de la glicoproteina de membrana GP63 de leishmania Carrillo, G.; Alonso, C.; Morales, G. El gen que codifica el antígeno de superficie más abundante de Leishmania infantum, la Gp63, ha sido clonado y secuenciado. A pesar de la homología general que se encuentra al compararlo con genes de otras especies de Leishmania, en particular con el gen expresado constitutivamente por Leishmania ehagasi, los extremos correspondientes al carboxilo terminal de la proteína son claramente divergentes (62% homología). Para estudiar la predominancia de los anticuerpos anti-Gp63 en sueros de perros con leishmaniasis visceral, se clonó y expresó Gp63 recombinante en Eseheriehia eolio El 100% de dichos sueros reconoció la proteína recombinante sugiriendo que podría funcionar como un potente inmunógeno de células B durante la leishmaniasis visceral canina. Sin embargo, se observó heterogeneidad en el nivel de respuesta de los sueros. Mediante el uso de 6 fragmentos solapantes de la Gp63 y de una colección de péptidos sintéticos se analizaron sus determinantes antigénicos. Los datos muestran que debe existir un cierto grado de restricción inmunológica en el reconocimiento de la proteína ya que se observa una reactividad preferente con la región más divergente de la misma. El mapeo de epitopos de esta región mostró la existencia de dos péptidos inmunodominantes y la respuesta inmunológica producida contra ellos es preferencialmente del tipo IgG2a, isotipo asociado a la respuesta de tipo Thl.; The Gp63 gene encoding the major surface antigen of Leishmania infantum has been cloned and sequenced. In spite of the overall sequence homology with the gp63 genes from other Leishmania species, particularly with the constitutively expressed Leishmania ehagasi Gp63 gene, the 3'ends of these genes are clearly divergent (62% homology). To study tbe prevalence of anti-gp63 antibodies in the sera from dogs with visceralleishmaniasis, a recombinant L. infantum gp63 protein was expressed in Eseheriehia eolio 100% of the sera from tbese dogs recognized the recombinant gp63 protein suggesting that it must function as a potent B cell immunogen during natural canine visceral leishmaniasis. However, heterogeneity in the level of response was observed. Fine mapping of the antigenic determinants was performed by means of 6 overlapping subfragments of the gp63 protein and by the use of a library of synthetic peptides. The data showed that there is some degree of immunological restriction in the recognition of the protein since preferential reactivity was observed against the most divergent region, Epitope mapping of this region showed two immunodominant peptides the response to wruch is preferentially ofthe Ig02a type, isotype associated to Thl response.

Soto, M. Requena, J. M. Quijada, L. Alonso, C. https://hdl.handle.net/10481/68737 2021-06-15T16:36:33Z

Localización de epítopos en distintos antígenos de Leishmania infantum. Aplicación en el desarrollo de un sistema de diagnóstico serológico Soto, M.; Requena, J. M.; Quijada, L.; Alonso, C. En este trabajo se describe la caracterización de cinco proteínas antigénicas de Leíshmania infantum, el agente etiológico de la leishmaniosis visceral canina en España. Las proteínas aisladas fueron dos histonas, la H2A y la H3, y tres proteínas ribosomales de la familia de las proteínas ácidas, la LiP2a, LiP2b y LiPO. Todas ellas se caracterizaron tras el aislamiento de los genes que las codificaban en forma de cDNAs contenidos en librerías construidas en fagos egtll. El aislamiento se llevó a cabo tras rastrear las librerías con sueros obtenidos de perros infectados de forma natural por el parásito. El análisis de secuencia mostró que aunque estas proteínas en Leishmania poseían un carácter conservado existían regiones donde aparecían secuencias específicas para el parásito. Precisamente fue en estas regiones donde se localizaron los determinantes antigénicos de las diferentes proteínas. Con el fin de desarrollar un sistema de diagnóstico serológico de la leishmaniosis canina, las regiones antigénicas de las cinco proteínas fueron expresadas y purificadas como polipéptidos recombinantes. La utilización de estos antígenos recombinantes en ensayos de ELISA demostró la potencialidad del uso de estas proteínas para el desarrollo de sistemas de diagnóstico serológico sensibles y específicos de la leishmaniosis canina.; In this work we describe tbe characterization offive antigenic proteins of Leishmania infantum, parasite whose infection cause 'canine visceral leishmaniosis in Spain. The following antigenic proteins were cbaracterized: tbe histones H2A and H3, and three members of tbe acidic ribosomal protein family, LiP2a, LiP2b and LiPO. All of tbem were isolated after isolation of tbeir cDNAs by immunoscreening of aL. infantum egtll expression library witb tbe sera from dogs nattirally infected witb tbe parasite. Aminoacid sequence analysis showed that alI of them were conserved relative to the eukaryotic equivalent proteins but also that they possessed divergent regions. Epitope mapping demonstrated that the antigenic determinants were always located in these specific regions of the parasite proteins. In order to develop a serodiagnosis test for canine leishmaniasis these antigenic regions were expressed and purified as independient polypeptides. The usefulness of these recombinant proteins in ELISA assays for canine leishmaniasis diagnosis has been analyzed.