@misc{10481/78925,
year = {2023},
url = {https://hdl.handle.net/10481/78925},
abstract = {En la presente Tesis Doctoral se han abordado dos principales
estrategias para la generación de nuevos sustitutos de nervio periférico mediante
ingeniería tisular, que podrían ser también aplicados a otros tejidos como la piel
humana. En primer lugar, se evaluó el impacto del entrecruzamiento químico con
el agente natural genipín en sustitutos de nervio descelularizados previamente
descritos (métodos de Sondell y Roosens). El objetivo de esta primera estrategia
fue generar matrices neurales con propiedades mecánicas mejoradas. El impacto de dos concentraciones de genipín (0.10 y 0.25%) en las matrices
neurales descelularizadas fue evaluado a nivel histológico, biomecánico y
biológico. En segundo lugar, se desarrollaron tres nuevos métodos de
descelularización química con el objetivo de lograr un grado eficiente de
eliminación del componente celular y una adecuada preservación de la
estructura y composición de la matriz extracelular neural. Estos nuevos
aloinjertos neurales descelularizados fueron sometidos a una completa
caracterización ex vivo y posteriormente se evaluó su eficacia terapéutica in vivo.
En el primer estudio, la histología confirmó las diferencias entre los métodos de
Sondell y Roosens, y que el entrecruzamiento con genipín no indujo cambios
histológicos evidentes, corroborando una adecuada preservación de la histología
del nervio. La prueba biomecánica de tracción reveló que genipín mejoró las
propiedades biomecánicas de los aloinjertos nerviosos descelularizados de
Sondell y Roosens, siendo estos últimos los más comparables al
comportamiento biomecánico de los nervios nativos utilizados como control. La
evaluación de la biocompatibilidad de los aloinjertos nerviosos descelularizados
realizada con células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo, y
cultivadas sobre las matrices generadas, confirmó un alto grado de
biocompatibilidad en todos los grupos. Los resultados fueron especialmente
positivos en el grupo Roosens tratados con 0,10% de genipín. Finalmente, este
estudio demostró que el uso de genipín podría ser una alternativa eficiente para
mejorar las propiedades biomecánicas de los aloinjertos nerviosos
descelularizados con un ligero impacto en la biocompatibilidad y el patrón
histológico. Por estas razones, planteamos la hipótesis de que nuestros nuevos
aloinjertos nerviosos descelularizados reticulados podrían ser una alternativa
adecuada para futuros estudios preclínicos in vivo.
En segundo lugar, se llevó a cabo una completa caracterización (histológica,
ultraestructural, bioquímica, biomecánica y de biocompatibilidad) de los tres
nuevos aloinjertos descelularizados de nervio periférico. En estos tres nuevos
métodos químicos-enzimáticos se utilizaron diferentes concentraciones de
detergentes (Tritón X-100, dodecil sulfato de sodio, desoxicolato de sodio) y
enzimas (ARNasa y ADNasa) o, en su defecto, una solución de ácido perácetico,
y se compararon con la eficacia del método de Sondell. El análisis histológico demostró una eliminación de material celular y mielina eficiente. El análisis de la
matriz extracelular confirmo un alto grado de preservación de las fibras de la
matriz, así como de la glicoproteína laminina, especialmente en los protocolos 1
y 2. Por último, no se observaron cambios significativos a nivel biomecánico, y
las todas las matrices mostraron un alto grado de biocompatibilidad ex vivo.
En función de los resultados ex vivo, se seleccionaron los protocolos 1 y 2, cuya
eficacia regenerativa fue evaluada a las 15 semanas tras la reparación de
defectos de 10-mm de longitud en el nervio ciático de ratas. Se utilizaron como
controles, el método gold standard y sustitutos descelularizados obtenidos
mediante la técnica de Sondell. El análisis clínico y funcional confirmó un grado
de recuperación motora y sensitiva parcial y comparable al autoinjerto nervioso.
La evaluación histológica, immunohistoquímica, ultraestructural y morfométrica
confirmó la regeneración del tejido nervioso a lo largo de los injertos implantados,
siendo, siendo el Protocolo 2 el protocolo el más eficaz, ya que los resultados
fueron comparables al grupo autoinjerto, pero sin lograr superarlo.
Finalmente, los resultados obtenidos en esta Tesis doctoral avalan por un lado,
la utilización de genipín para generar sustitutos nerviosos descelularizados
biocompatibles con propiedades biomecánicas mejoradas. Por otro lado, ha sido
posible desarrollar un nuevo método de descelularización neural altamente
eficiente, cuyos resultados in vivo fueron comparables al autoinjerto nervioso.
Estos resultados sugieren que estos nuevos aloinjertos descelularizados podrían
ser una terapéutica en la reparación quirúrgica de lesiones de nervios periféricos
y podrían tener utilidad en la regeneración de otras estructuras como la piel
humana.},
abstract = {In the present PhD Thesis  were addressed two main strategies in order to generate new peripheral nerve substitutes by tissue engineering, which could also be applied to other tissues such as human skin. First, the impact of chemical crosslinking with the natural agent genipin on previously described
decellularized nerve substitutes (Sondell and Roosens methods) was evaluated. The aim of this first strategy was to generate neural matrices with improved
mechanical properties. The impact of two concentrations of genipin (0.10 and
0.25%) on decellularized neural matrices was evaluated at the histological, biomechanical and biological levels. Secondly, three new chemical
decellularization methods were developed with the aim of achieving an efficient
degree of cellular component removal and adequate preservation of neural
extracellular matrix structure and composition. These new decellularized neural
allografts were subjected to a complete ex vivo characterization and
subsequently evaluated for their therapeutic efficacy in vivo.
In the first study, histology confirmed the differences between the Sondell and
Roosens methods, and the crosslinking with genipin did not induce obvious
histological changes, corroborating adequate preservation of nerve histology.
Biomechanical tensile testing revealed that genipin improved the biomechanical
properties of decellularized Sondell and Roosens nerve allografts, being the latter
the most comparable to the biomechanical behavior of native nerves used as
controls. Evaluation of the biocompatibility of decellularized nerve allografts
performed with adipose tissue-derived mesenchymal stem cells cultured on the
generated matrices confirmed a high degree of biocompatibility in all groups. The
results were especially positive in the Roosens group treated with 0.10% genipin.
Finally, this study demonstrated that the use of genipin could be an efficient
alternative to improve the biomechanical properties of decellularized nerve
allografts with a slight impact on biocompatibility and histological pattern. For
these reasons, we hypothesized that our new crosslinked decellularized nerve
allografts could be a suitable alternative for future in vivo preclinical studies.
Secondly, a complete characterization (histological, ultrastructural, biochemical,
biomechanical and biocompatibility) of the three new decellularized peripheral
nerve allografts was carried out. In these three new chemical-enzymatic
methods, different concentrations of detergents (Triton X-100, sodium dodecyl
sulfate, sodium deoxycholate) and enzymes (RNAase and DNAase) or,
alternatively, a peracetic acid solution were used and compared with the efficacy
of Sondell's method. Histological analysis demonstrated efficient removal of
cellular material and myelin. Extracellular matrix analysis confirmed a high degree
of preservation of matrix fibers as well as laminin glycoprotein, especially in
protocols 1 and 2. Finally, no significant changes were observed at the
biomechanical level, and all matrices showed a high degree of ex vivo
biocompatibility. Based on the ex vivo results, protocols 1 and 2 were selected, whose
regenerative efficacy was evaluated at 15 weeks after repair of 10-mm-gap
defects in the sciatic nerve of rats. The gold standard method and decellularized
substitutes obtained by the Sondell technique were used as controls. Clinical and
functional analysis confirmed a degree of partial motor and sensory recovery
comparable to the nerve autograft. Histological, immunohistochemical,
ultrastructural and morphometric evaluation confirmed the regeneration of nerve
tissue along the implanted grafts, being protocol 2 the most effective, since the
results were comparable to the autograft group, but without surpassing it.
Finally, the results obtained in this Doctoral Thesis support, on the one hand, the
use of genipin to generate biocompatible decellularized nerve substitutes with
improved biomechanical properties. On the other hand, it has been possible to
develop a new highly efficient neural decellularization method, whose in vivo
results were comparable to nerve autografting. These results suggest that these
new decellularized allografts could be a therapeutic in the surgical repair of
peripheral nerve injuries and could be potentially useful for the regenerative
treatment of diseases affecting other tissues such as the human skin.},
organization = {Tesis Univ. Granada.},
organization = {Grupo de Investigación CTS-115},
organization = {Proyectos de investigación: FIS PI17/393 y FIS PI20/318 del Plan nacional de Investigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica (I+D+I)},
organization = {Instituto de Salud Carlos III},
organization = {Ministerio de Ciencia e Innovación (cofinanciados por fondos FEDER, UE); proyecto P18-RT-5059, Proyectos I+D+I, Plan Andaluz de Investigación Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020)},
organization = {Junta de Andalucía. España; proyecto A-CTS-498-UGR18},
organization = {Proyectos I+D+I del Programa Operativo FEDER 2018},
organization = {Junta de Andalucía},
organization = {Universidad de Granada},
organization = {Proyectos CS PI-0257- 2017 y CSyF PE-0395-2019, Consejería de Salud y Familias de la Junta de Andalucía, España},
publisher = {Universidad de Granada},
keywords = {Ingeniería tisular},
keywords = {Nervio periférico},
keywords = {Descelularización química},
title = {Generación y evaluación in vivo de modelos bioartificiales de nervio periférico descelularizado de estructura y visco-elasticidad controladas},
author = {García García, Óscar Darío},
}