@misc{10481/75621,
year = {2022},
url = {http://hdl.handle.net/10481/75621},
abstract = {Zoonotic diseases have caused the world’s biggest pandemics in recent history. HIV was
first identified in 1981 and, since then, 70 million people have been infected with HIV
and more than 37 million have died from AIDS-related illnesses. 40 years after, the
SARS-CoV-2 outbreak let the world shocked crushing economies and killing more than
6 million people within the ongoing COVID-19 global pandemic.
Preventing those viruses from entering the host’s cells constitutes a major goal in the
development of effective anti-viral therapies. As enveloped viruses, HIV and SARSCoV-
2 need to fuse their membranes with those of human cells in order to infect them.
Their class-I fusion machines, the HIV Envelope and the SARS-CoV-2 Spike
respectively are responsible for membrane fusion. In this process the N-terminal Heptad
Repeat (NHR or HR1) regions of gp41 and S2 subunits stand out because of their high
conservation and because their interaction with the C-terminal Heptad Repeat (CHR or
HR2) region is the driving force that ultimately leads to membrane fusion. Consequently,
HR1 and HR2 represent vulnerable sites for the development of broad and effective
therapies. In previous works, we designed and studied chimeric miniproteins (named
covNHR) that mimic the exposed NHR of HIV gp41 in its pre-hairpin conformation as
fusion inhibitors and as molecular models to explore the complexity of the interactions
governing their function. In this thesis:
We have used the covNHR miniproteins in combination with a small-molecule
fluorescent probe to investigate the conformational and dynamic properties of a
conserved hydrophobic pocket (HP) located in the NHR-groove, which is a promising
target for the development of small-molecule inhibitors. We demonstrated that the HP is
conformationally flexible and connected allosterically to other NHR regions, which
strongly influence the binding of potential ligands.
We have studied the role of buried polar residues in the interior of the NHR coil by
mutating them to a hydrophobic amino acid, Isoleucine. The mutants show an extreme
thermostability but an enhanced self-association and unaltered HIV-1 inhibitory activity.
The results support a role of buried core polar residues in maintaining structural
uniqueness and promoting an energetic coupling between conformational stability and
NHR–CHR binding.
We have further stabilized covNHR proteins with the addition of an intra-chain disulfidebond.
The new disulfide-bonded strongly stabilizes the miniprotein, increases binding
affinity for the CHR region and strongly improves HIV broad inhibitory activity, without
targeting the preserved HP motif of gp41. The results suggest new strategies to inhibit
HIV.
Finally, we have translated covNHR’s approach to design and characterize chimeric
proteins that imitate HR1 helical trimers of SARS-CoV-2 S2. The proteins bind strongly
HR2 and have broad inhibitory activity against WT and Omicron viruses. Moreover, they
are recognized by antibodies present in sera from COVID-19 patients, revealing
previously undetected Spike epitopes that may guide the design of new vaccine and
therapies.},
abstract = {Las enfermedades zoonóticas han causado las mayores pandemias en la historia reciente.
El VIH se identificó por primera vez en 1981 y, desde entonces, 70 millones de personas
se han infectado y más de 37 millones han muerto por enfermedades relacionadas con el
SIDA. 40 años después, el brote de SARS-CoV-2 ha dejado al mundo conmocionado,
aplastando las economías de muchos países y matando a más de 6 millones de personas
en el marco de la actual pandemia mundial de COVID-19.
Evitar que esos virus entren en las células del huésped constituye un objetivo importante
en el desarrollo de terapias antivirales eficaces. Al tratarse de virus envueltos, el VIH y
el SARS-CoV-2 necesitan fusionar sus membranas con las de las células humanas para
infectarlas. Sus máquinas de fusión de clase I son responsables de esta fusión. En este
proceso, las regiones con hepta-repeticiones N-terminales (NHR o HR1) de gp41 y S2
destacan por su alto nivel de conservación y porque su interacción con la región heptarepetida
C-terminal (CHR o HR2) es la fuerza impulsora que conduce a la fusión de
membranas. En consecuencia, HR1 y HR2 representan sitios vulnerables para el
desarrollo de terapias de amplio espectro y efectivas. En trabajos anteriores, diseñamos y
estudiamos proteínas, llamadas covNHR, que imitan el NHR de gp41 en su conformación
previa a la horquilla como inhibidores de fusión y como modelos moleculares para
explorar la complejidad de las interacciones que rigen su función. En esta tesis:
Se han utilizado las proteínas covNHR en combinación con una sonda fluorescente de
tipo molécula pequeña para investigar las propiedades conformacionales y dinámicas de
un bolsillo hidrofóbico (HP) conservado ubicado en el surco NHR, que es un objetivo
prometedor para el desarrollo de inhibidores de molécula pequeña. Demostramos que HP
es conformacionalmente flexible y está conectado alostéricamente a otras regiones de
NHR, lo que influye fuertemente en la unión de ligandos potenciales.
Se ha estudiado el papel de los residuos polares enterrados en el interior de NHR al
mutarlos a un aminoácido hidrófobo, la isoleucina. Estos mutantes muestran una
termoestabilidad extremadamente alta pero también una tendencia a la autoasociación y
una actividad inhibidora del VIH-1 inalterada. Los resultados respaldan el papel de los
residuos polares enterrados en el núcleo para el mantenimiento de la singularidad
estructural y la existencia de un acoplamiento energético entre estabilidad conformacional
y la unión de NHR-CHR.
Se ha estabilizado aún más las proteínas covNHR con la adición de un puente disulfuro
intracatenario. El nuevo enlace disulfuro estabiliza fuertemente la proteína, aumenta la
afinidad de unión por la región CHR y mejora fuertemente la amplia actividad inhibidora
del VIH, sin dirigirse frente al motivo HP conservado de gp41. Estos resultados sugieren
nuevas estrategias para lograr inhibir el VIH.
Finalmente, se ha trasladado el enfoque de las proteínas covNHR para diseñar y
caracterizar proteínas quiméricas que imitan los trímeros helicoidales HR1 de S2 en el
SARS-CoV-2. Las proteínas se unen fuertemente a HR2 y tienen una amplia actividad
inhibitoria contra la cepa original y contra Omicron. Además, son reconocidas por los
anticuerpos presentes en los sueros de pacientes de COVID-19, lo que revela epítopos de
la proteína de la espícula no detectados previamente que pueden guiar el diseño de nuevas
vacunas y terapias.},
organization = {Tesis Univ. Granada.},
organization = {Spanish State Research Agency, SRA/ 10.13039/501100011033 (grants BIO2016-76640-R and PID2019.107515RB.C21)},
organization = {Co-funded by ERDF/ESF, “A way to make Europe”/“Investing in your future},
organization = {Youth Employment Operative Program of the Andalusia Government},
publisher = {Universidad de Granada},
keywords = {Antivirales},
keywords = {Enfermedades zoonóticas},
keywords = {Zoonotic diseases},
keywords = {Antivirals},
title = {Development of therapeutic proteins and compounds against viruses with class-I fusion machines},
author = {Cano Muñoz, Mario},
}