@misc{10481/72865,
year = {2022},
url = {http://hdl.handle.net/10481/72865},
abstract = {First, we have explored the relationship between in vitro and in vivo protein folding, in
an evolutionary context. We have experimentally characterized the in vitro folding of a set of
resurrected Precambrian and modern thioredoxins and found that, contrary to previous claims
in the literature, the folding rates are not evolutionarily conserved. Thus, ancestral thioredoxins
fold much faster in the test tube than their modern counterparts. Extensive mutational analyses
have allowed us to identify mutation S74G as responsible for aggravating folding in E. coli
thioredoxin. The evolutionary acceptance of this mutation is interpreted as an example of
degradation of ancestral features at the molecular level. We propose that unassisted and
efficient primordial folding was linked to fast folding encoded at the sequence/structure level.
Once an efficient assistance machinery had emerged, mutations that impaired ancient
sequence/structure determinants of folding efficiency could be accepted, since those
determinants were no longer necessary. We conclude that in vitro and in vivo folding landscapes
are disconnected and question the biologically relevance of the in vitro folding rate
determinations, except as related to heterologous folding efficiency (see below).
In the second part of this thesis, we have addressed a pivotal and common problem in
biotechnology, the inefficient heterologous expression of proteins. As a model system
thioredoxin from Candidatus Photodesmus katoptron, an uncultured symbiotic bacteria of
flashlight fish, has been used. Our results demonstrate its slow in vitro folding (it takes several
hours to reach the native state) and inefficient expression in E. coli, leading mostly to insoluble
protein. By using a few back-to-the-ancestral mutations at positions selected by computational
modelling of the unassisted folding landscape we were able to rescue its inefficient expression.
Our results support that the folding of proteins in foreign hosts may be akin to some extent to
unassisted folding due to the absence of coevolution of the recombinant protein with the
natural chaperones of the new host. More generally, our results provide an approach based on
sequence engineering to rescue inefficient heterologous expression with a minimal protein
perturbation.},
abstract = {En primer lugar, hemos explorado la relación entre el plegamiento de proteínas in vitro
e in vivo, en un contexto evolutivo. Hemos caracterizado experimentalmente el plegamiento in
vitro de un conjunto de tiorredoxinas precámbricas y modernas y hemos descubierto que, al
contrario de lo que ha sido afirmado recientemente en la literatura, la velocidad de plegamiento
no ha sido conservada a lo largo de la evolución. Las tiorredoxinas ancestrales se pliegan mucho
más rápido in vitro que sus homólogas modernas. Un extenso análisis mutacional nos ha
permitido identificar que la mutación S74G es la responsable de hacer más lento el plegamiento
en la tiorredoxina de E. coli. La aceptación evolutiva de esta mutación se interpreta como un
ejemplo de degradación de rasgos ancestrales a nivel molecular. En nuestro trabajo, se propone
que el plegamiento primordial, supuestamente no asistido y eficiente, está ligado a un
plegamiento rápido que debe estar codificado a nivel de secuencia / estructura. Pero, una vez
surgió la maquinaria de asistencia para el plegamiento, se aceptaron mutaciones que dañaban
los determinantes de secuencia / estructura que codificaban para un plegamiento rápido in
vitro, ya que esta característica dejó de ser necesaria. Por tanto, en este trabajo se concluye que
los paisajes de plegamiento in vitro e in vivo están desconectados y se cuestiona la importancia
biológica de la velocidad de plegamiento in vitro, excepto en los casos de expresión heteróloga
(ver más abajo).
En la segunda parte de esta tesis, hemos abordado uno de los problemas más comunes
en biotecnología, la ineficiente expresión heteróloga de proteínas. Como sistema modelo, se ha
utilizado la tiorredoxina de Candidatus Photodesmus katoptron, una bacteria simbiótica no
cultivable del pez linterna. Nuestros resultados demuestran que esta proteína presenta un plegamiento in vitro muy lento (necesita varias horas para alcanzar su estado nativo) y su
expresión es ineficaz en E. coli, lo que lleva principalmente a la obtención de proteína insoluble.
Mediante el uso de mutaciones de vuelta al ancestro, en determinadas posiciones seleccionadas
por un modelo computacional del paisaje de plegamiento, pudimos rescatar su expresión.
Nuestros resultados apoyan que el plegamiento de proteínas en un huésped diferente, puede
ser similar, en cierta medida, al plegamiento no asistido debido a la ausencia de coevolución de
la proteína recombinante con las chaperonas naturales del nuevo huésped. De manera más
general, nuestros resultados desarrollan un enfoque basado en la ingeniería de secuencias para
rescatar la expresión heteróloga ineficaz con una perturbación mínima de la proteína.},
organization = {Tesis Univ. Granada.},
organization = {FEDER Funds, grant BIO2015-66426-R from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness},
organization = {Grant RGP0041/2017 from the Human Frontier Science Program},
organization = {Uppsala University},
publisher = {Universidad de Granada},
keywords = {Enzimas},
keywords = {Enzymes},
keywords = {Proteínas},
keywords = {Proteins},
keywords = {Ingeniería de proteínas},
keywords = {Protein engineering},
title = {Engineering, evolution and folding of enzymes with natural and non natural activities},
author = {Gámiz Arco, María Gloria},
}