Selección y caracterización de RNAs dirigidos contra el dominio genómico CRE del virus de la hepatitis C (HCV)

Abstract

El virus de la hepatitis C (HCV) tiene un genoma de RNA de polaridad positiva de aproximadamente 9600 nucleótidos. Durante la replicación se genera una alta variabilidad genómica debido a la falta de actividad correctora de errores de la RNA polimerasa viral (NS5B). La gran variabilidad le posibilita al virus adaptarse rápidamente a cambios de su entorno, permitiendo la aparición de variantes resistentes a los tratamientos específicos que tienen como diana a las proteínas virales. A pesar de la alta variabilidad genética, el genoma del HCV presenta dominios genómicos conservados tanto en secuencia como en estructura, que en sí mismos cumplen funciones esenciales en procesos claves del ciclo viral. La acción directa de inhibidores contra estas regiones es una estrategia muy prometedora para el abordaje de una terapia antiviral. En la región 3' codificante de la proteína NS5B se encuentra un elemento genómico que es esencial para la replicación, llamado CRE (del inglés cis acting replication element). El CRE se pliega en una estructura cruciforme compuesta por tres motivos tallo lazo, 5BSL3.1, 5BSL3.2 y 5BSL3.3. En el presente trabajo se aplicó un método de selección molecular in vitro (SELEX) con el fin de seleccionar moléculas que se unan específicamente (aptámeros) al CRE, de forma tal que puedan tener un efecto sobre su función en el proceso de replicación viral. El análisis de las secuencias obtenidas después de nueve rondas de selección, permitió identificar cinco motivos de secuencias presentes en las variantes seleccionadas de las poblaciones P6, P7, P8 y P9. Los motivos eran complementarios a cinco regiones del CRE pudiéndose identificar cinco dianas potenciales para la unión. Mediante ensayos de protección frente a la RNasa T1 y Pb2+ se identificaron experimentalmente cuatro de ellas. Aptámeros con distintas dianas de unión en el CRE se utilizaron para transfectar líneas celulares Huh-7 portadoras de replicones sub-genómicos del virus de la hepatitis C y se vio que eran capaces de inhibir hasta un 80% la replicación viral. El dominio CRE como diana de acción para una terapia anti-HCV no ha sido caracterizado hasta la fecha. Los resultados aportados en este trabajo describen al dominio genómico CRE como una diana terapéutica potencial y muestran la aplicación de aptámeros de RNA para el estudio de procesos claves en la biología del HCV como lo es la replicación.