Expresión del gen isopentenil transferasa (IPT) y su acción sobre la deficiencia de nitrógeno en plantas de tabaco

Abstract

El gran reto del Siglo XXI es la creación de una ¿segunda revolución verde¿ basada en una mejora de la producción de los cultivos que asegure alimento a la población mundial junto con una aplicación reducida de fertilizantes. La alternativa más razonable para conseguir este objetivo es la utilización de especies o genotipos de plantas que muestren capacidad para crecer y producir de forma óptima en suelos o medios de cultivo con una baja disponibilidad de nutrientes, especialmente de nitrógeno (N), uno de los factores que determina gran parte de la producción vegetal. La utilización de estas plantas con una fertilización reducida es la estrategia más lógica para mantener y desarrollar una agricultura sostenible, rentable económicamente y respetuosa con el medioambiente. Teniendo en cuenta que las plantas tienen una dependencia fundamental del N para su crecimiento se aplican aproximadamente entre 85-90 millones de toneladas de fertilizantes nitrogenados al suelo anualmente, por lo que en la actualidad se hace imprescindible la reducción de este tipo de fertilizantes y especialmente en forma de nitratos (NO3-) que es considerado uno de los principales contaminantes agrícolas.

El N es un macronutriente esencial para las plantas, siendo cuantitativamente uno de los elementos minerales más abundantes en los tejidos vegetales. Por tanto, la deficiencia de N, fundamentalmente de nitrato (NO3-), ha sido definida como uno de los factores más limitantes en el crecimiento de los cultivos. Las citoquininas (CKs) son fitohormonas que tradicionalmente han sido relacionadas con procesos como división celular, crecimiento y desarrollo, dominancia apical o senescencia, pero en los últimos años ha sido estudiada la implicación de las CKs en la señalización del estado nutricional y se conoce que esta fitohormona influye en la homeostasis de algunos nutrientes como N, fósforo (P), azufre (S), hierro (Fe). La relación entre CKs y N ha sido la más ampliamente estudiada y se sabe que actúan como mensajeros a larga distancia que controlan la asimilación de este nutriente y el estatus de éste en la planta, por lo que estas hormonas podría ser buenos candidatos para mejorar la utilización del N plantas y poder así reducirse la aplicación de fertilizantes nitrogenados. Por ello y utilizando como diseño experimental la comparación entre plantas de tabaco wild type (WT) y plantas modificadas geneticamente que expresan el gen IPT responsable de la síntesis de CKs, los objetivos de esta tesis doctoral fueron los siguientes:

1. Establecer las respuestas fisiológicas de las plantas a la deficiencia de N y definir la implicación en éstas de la expresión del gen IPT.

2. Evaluar si la expresión del gen IPT en plantas puede concretarse como una herramienta válida y eficaz para mejorar el uso de N y poder reducir así la aplicación de fertilizantes nitrogenados.

Para lograr dichos objetivos se llevaron a cabo los experimentos que se detallan a continuación y en los que se obtuvieron los siguientes resultados:

- Efecto de las CKs sobre el estrés oxidativo en plantas de tabaco sometidas a deficiencia de N Plantas de tabaco WT y plantas transgénicas que sobreexpresan el gen IPT, enzima que codifica el paso clave de la síntesis de citoquininas (CKs), crecieron bajo condiciones de deficiencia de N (7 mM y 1 mM de NO3-). Nuestros resultados muestran que las plantas WT sometidas a deficiencia de N redujeron la biomasa y la tasa de crecimiento relativo (RGR) incrementando el daño oxidativo y reduciendo las concentraciones foliares de las distintas formas de N. Sin embargo, las plantas transgénicas PSARK::IPT, a pesar de mostrar un descenso significativo de las formas de N en hoja, no mostró alteración del metabolismo oxidativo manteniendo así la biomasa foliar y el RGR bajo deficiencia de N.

- Formación y asimilación de amonio en plantas transgénicas de tabaco PSARK::IPT bajo deficiencia de nitrógeno Se analizaron las enzimas relativas al metabolismo del N y fotorrespiración junto con las formas de N y los aminoácidos (aas) en plantas de tabaco WT y PSARK::IPT sometidas a deficiencia de N. Nuestros resultados indican que las plantas WT redujeron la asimilación de NO3-. Sin embargo, en estas plantas incrementaron la producción de amonio (NH4+) mediante procesos como la degradación de proteínas y la fotorrespiración lo que conllevó un incremento del ciclo glutamina sintetasa/glutamato sintasa (GS/GOGAT). Además en plantas WT la cantidad de aas disminuyó bajo deficiencia de N, aunque la cantidad relativa de glutamato y glutamina incrementó. A pesar de que en las plantas transgénicas las formas de N disminuyeron bajo deficiencia de N, éstas mantuvieron el ciclo GS/GOGAT a niveles del control. Nuestros resultados parecen indicar que bajo deficiencia de N, las CKs previenen de la formación y asimilación de NH4+ que se genera en procesos como la fotorrespiración o la degradación de proteínas.

- Mejora dependiente de CKs de la eficiencia del uso del N y la calidad de plantas transgénicas de tabaco PSARK::IPT sometidas a deficiencia de N Se evaluó el papel de las CKs en la eficiencia del uso del N (NUE) y diferentes parámetros que determinan la calidad de las hojas de tabaco. Los resultados obtenidos indicaron que las plantas de tabaco WT sometidas a deficiencia de N redujeron el cociente hojas:raíz asociado a un descenso del NUE y de los parámetros de calidad de la hoja de tabaco. Por el contrario, las plantas transgénicas PSARK::IPT sometidas a deficiencia de N presentaron un mayor NUE así como mayor calidad de las hojas que las plantas WT, como reducción en la cantidad de nicotina e incremento de azucares reducidos. Por tanto la expresión del gen IPT podría ser una herramienta útil para mejorar el cultivo de tabaco, reduciendo la aplicación de fertilizantes, manteniendo la producción e incrementando la calidad de la hoja.

- Respuesta de metabolitos ricos en carbono y N frente a la deficiencia de N en plantas de tabaco PSARK::IPT Se analizó el posible efecto de la deficiencia de N sobre compuestos ricos en carbono, como los compuestos fenólicos así como en compuestos ricos en N como poliaminas (PAs) y prolina (Pro), examinando las rutas implicadas en su síntesis y degradación. La deficiencia de N estimuló el metabolismo fenólico incrementando la cantidad de fenoles en ambas líneas de plantas de tabaco WT y PSARK::IPT. Esto sugiere que la concentración NO3- en los tejidos podría actuar como señal favoreciendo la acumulación de compuestos fenólicos bajo deficiencia de N. Además encontramos que en las plantas WT las PAs libres se mantuvieron a pesar de la deficiencia de N, lo que podría estar relacionado con una mayor respuesta al estrés generado por la baja disponibilidad de N en estas plantas. Por el contrario, la reducción de PAs libres y Pro observada en plantas PSARK::IPT bajo deficiencia de N podría indicar una activación de mecanismos de reciclaje de N que ayudaría a estas plantas a un uso más eficiente de N.

- La expresión de PSARK::IPT causa protección de la fotosíntesis en plantas de tabaco durante la deficiencia de N En este trabajo realizado en la Universidad de Davis-CA (USA) se midieron parámetros fotosintéticos y del metabolismo de los azucares en plantas de tabaco WT y PSARK::IPT sometidas a deficiencia de N. Los resultados obtenidos indican que las plantas WT mostraron una drástica reducción de la tasa fotosintética (A) y de parámetros como el cociente máximo de carboxilación de la Rubisco (Vcmax), el cociente máximo de la cadena de transporte electrónico (Jmax) así como del uso de las triosas-P (TPU). Sin embargo, la expresión del gen IPT bajo el control del promotor PSARK, inducido por maduración y estrés, conllevó un mantenimiento de la fotosíntesis y de los parámetros Vcmax (manteniendo el nivel de expresión de la subunidad pequeña de la Rubisco (sm-Rubisco)), Jmax y TPU, conservando así la biomasa foliar bajo condiciones de deficiencia de N. El limitado incremento de la concentración de azucares junto con el mantenimiento de la biomasa foliar en las plantas transgénicas observado podrían indicar un posible papel de las CKs en la limitación del sumidero provocado por la deficiencia de N, mejorando la fuerza del sumidero, formado por las hojas jóvenes, y por tanto mejorando la biomasa foliar bajo condiciones de deficiencia severa de N (1mM).

Por tanto las conclusiones que derivan de los trabajos que acabamos de describir serían las siguientes:

1. La deficiencia de N conlleva una reducción de la biomasa y de la tasa de crecimiento relativo foliar en plantas de tabaco WT, debido a un descenso de las diferentes formas de N y una inducción de especies reactivas de oxigeno (ROS) y por tanto del daño oxidativo. Por el contrario, en las plantas de tabaco PSARK::IPT la deficiencia de N no afectó la producción de ROS manteniéndose la biomasa y la tasa de crecimiento relativo foliar a pesar de que también se reduce la concentración de las distintas formas de N. Esta repuesta diferencial nos sugiere que el aumento de CKs en plantas de tabaco PSARK::IPT podría actuar como señal impidiéndose la aparición de las respuestas típicas de la deficiencia de N.

2. Ante una deficiencia de N severa las plantas WT activan los procesos de generación de NH4+ independientes de la reducción del NO3-, como son la fotorrespiración, la degradación de proteínas y el aumento de los niveles relativos de aas de transporte, todo ello con el fin de suministrar N a zonas de crecimiento. Por el contrario, las plantas transgénicas PSARK::IPT no inducen estas respuestas típicas de la deficiencia de N lo que les permite en estas condiciones un mantenimiento de la biomasa foliar y una mejora en la calidad de las hojas de tabaco así como en la eficiencia del uso del N.

3. La deficiencia de N estimula el metabolismo fenólico incrementando la cantidad de fenoles, lo cual podría definirse como respuesta a la baja concentración NO3- existentes en los tejidos. El mantenimiento de la cantidad de PAs en plantas de tabaco WT bajo deficiencia de N podría estar relacionado con el mayor estrés oxidativo observado previamente en dichas plantas. Por el contrario la reducción de PAs y Pro en las plantas transgénicas podría representar un mecanismo de reciclaje de N bajo situaciones de baja disponibilidad de dicho nutriente.

4. La expresión del gen IPT en plantas de tabaco sometidas a deficiencia de N conlleva un mantenimiento de la fotosíntesis de tal manera que las CKs podrían actuar protegiendo este proceso fisiológico lo que se demuestra por el mantenimiento de los niveles de transcrito de la sm-Rubisco, la cadena de transporte electrónico y la capacidad del cloroplasto para usar las triosas-P. En relación a la relación fuente-sumidero, la inducción en la síntesis de CKs podría ayudar a potenciar la fuerza del sumidero que representan las hojas jóvenes, mejorando la biomasa foliar bajo condiciones de deficiencia severa de N.