Universidad de Granada Facultad de Medicina Departamento de Microbiología Betalactamasas de espectro extendido en nuestro medio: Aportaciones científicas. Antonio Sorlózano Puerto Granada, 2004 D. GONZALO PIÉDROLA ANGULO, CATEDRÁTICO DE MICROBIOLOGÍA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE GRANADA. CERTIFICA: Que D. ANTONIO SORLÓZANO PUERTO, Licenciado en Medicina y Cirugía, ha realizado el trabajo de Tesis Doctoral bajo mi dirección, sobre el tema ?Betalactamasas de espectro extendido en nuestro medio: Aportaciones científicas.?, el cual ha finalizado con aprovechamiento, para optar al Título de Doctor, siempre que así lo considere el superior juicio del tribunal nombrado al efecto. Fdo: D. GONZALO PIÉDROLA ANGULO D. JOSÉ GUTIÉRREZ FERNÁNDEZ, PROFESOR TITULAR DE MICROBIOLOGÍA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE GRANADA. CERTIFICA: Que D. ANTONIO SORLÓZANO PUERTO, Licenciado en Medicina y Cirugía, ha realizado el trabajo de Tesis Doctoral bajo mi dirección, sobre el tema ?Betalactamasas de espectro extendido en nuestro medio: Aportaciones científicas.?, el cual ha finalizado con aprovechamiento, para optar al Título de Doctor, siempre que así lo considere el superior juicio del tribunal nombrado al efecto. Fdo: D. JOSÉ GUTIÉRREZ FERNÁNDEZ A partir de esta tesis se han generado las siguientes publicaciones: Artículos en revistas de difusión internacional: Sorlózano A, Gutiérrez J, Fernández F, et al. 2004. A preliminary study on the presence of extended-spectrum ?-lactamases (ESBL) in clinical isolates of Escherichia coli in Granada (Spain). Ann. Microbiol. 54: 227- 232. Sorlózano A, Gutiérrez J, Palanca M, et al. 2004. High incidence of extended-spectrum ?-lactamases among outpatient clinical isolates of Escherichia coli: A phenotypic assessment of NCCLS guidelines and a commercial method. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. (Aceptado para publicación) Sorlózano A, Gutiérrez J, Piédrola G, et al. 2004. A good performance of Vitek 2 system to detect extended-spectrum ?-lactamases in clinical isolates of Escherichia coli: A comparative study of phenotypic commercial methods and NCCLS guidelines. (Enviado a: Diagnostic Microbiology and Infectious Disease) Libros: Sorlózano A, Gutiérrez J y Piédrola G. 2004. Los antibióticos betalactámicos en el siglo XXI. Repercusiones clínicas de las resistencias emergentes. Ed: Grupo Editorial Universitario. Granada. Comunicaciones a congresos: Palanca M, Sorlózano A, Carlos S, et al. 2003. Alta incidencia de betalactamasas de espectro extendido en aislados clínicos de Escherichia coli de un hospital regional español. XVI Congreso SAMPAC. Comunicación IIA/25. Sevilla. Palanca M, Sorlózano A, Fernández F, et al. 2003. Evaluación del sistema WIDER en la detección de betalactamasas de espectro extendido. XVI Congreso SAMPAC. Comunicación IIA/30. Sevilla. Antes de iniciar el desarrollo del presente trabajo, deseo expresar mi más sincera gratitud a todos aquellos que con su ayuda lo han hecho posible: A mis directores, los profesores Gonzalo Piédrola Angulo y José Gutiérrez Fernández, por presentarme a las bacterias y descubrir y cultivar en mí un verdadero y creciente interés por estos organismos, así como por la colaboración e interés constante que han prestado a lo largo de la realización de esta Tesis Doctoral. A la doctora María del Carmen Maroto Vela, jefa del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital ?San Cecilio? de Granada, por el apoyo y estímulo a lo largo de estos años. A los facultativos y compañeros del Servicio de Microbiología del Hospital ?San Cecilio?, Juan Román, José Liébana, José Antonio Pérez, Marta Álvarez, Trinidad Escobar, Fernando García, Carmen Bernal y Federico García, por los momentos compartidos y por permitirme aprender de ellos. A los amigos que me acompañaron en el recorrido de la Microbiología durante cuatro años: Rosa Guerrero, Sonia Suárez, Fernando Fernández, Rosa Daza, Francis Arjona, Natalia Chueca, Alejandro Peña, Mati Palanca y Silvia Carlos. A los administrativos, auxiliares y técnicos de laboratorio, por los buenos momentos compartidos, cada día, durante estos años. No lo olvidaré. A los laboratorios bioMeriéux, Francisco Soria Melguizo S.A., IZASA S.A. y Oxoid, por facilitar los medios técnicos y de laboratorio necesarios para realizar este estudio. A los miembros del grupo de investigación CTS521, por el apoyo técnico y económico prestado. A los doctores Rafael Cantón y María Teresa Coque, del servicio de Microbiología del Hospital Ramón y Cajal de Madrid, por sus conocimientos, y por proporcionar los aislados bacterianos necesarios para realizar los estudios moleculares de este trabajo. Al doctor Jesús Oteo, del Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, por su colaboración en los estudios de clonalidad. Al doctor Juan de Dios Luna, por su inestimable ayuda en el campo de la Estadística. A la ?Fundación Hospital Clínico?, por favorecer, en el ámbito del Hospital ?San Cecilio?, la realización de trabajos de investigación. A mis amigos María, Puri, Noelia, Mari, Asun, Francis, José Luis y Javi. A todos, gracias. A mi familia. A Merche. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Mecanismo de acción de los antibióticos betalactámicos 1.2. Clasificación de los antibióticos betalactámicos 1.3. Estructura química y actividad clínica de las penicilinas 1.3.1. Bencilpenicilina o penicilina G 1.3.2. Fenoximetilpenicilina o penicilina V 1.3.3. Cloxacilina 1.3.4. Aminopenicilinas 1.3.5. Piperacilina 1.4. Estructura química y actividad clínica de los inhibidores de betalactamasas 1.5. Estructura química y actividad clínica de las cefalosporinas 1.5.1. Cefalosporinas de primera generación 1.5.2. Cefalosporinas de segunda generación 1.5.3. Cefalosporinas de tercera generación 1.5.4. Cefalosporinas de cuarta generación 1.6. Estructura química y actividad clínica de los antibióticos monobactámicos 1.7. Estructura química y actividad clínica de los antibióticos carbapenémicos 1.8. Inactivación enzimática de los antibióticos betalactámicos por betalactamasas 1.8.1. Betalactamasas cromosómicas 1.8.2. Betalactamasas plasmídicas 1.9. Betalactamasas de espectro extendido (BLEEs) 1.9.1. Introducción e historia Págs. 3 6 7 7 9 9 10 11 12 16 17 18 19 22 24 26 29 33 36 38 38 1.9.2. Tipos de BLEEs 1.9.2.1. Betalactamasas tipo TEM 1.9.2.2. Betalactamasas tipo SHV 1.9.2.3. Betalactamasas resistentes a inhibidores de betalactamasas (inhibitor-resistant betalactamases o IRT) 1.9.2.4. Betalactamasas tipo CTX-M 1.9.2.5. Betalactamasas tipo OXA 1.9.2.6. Otras BLEEs 1.9.3. Epidemiología 1.9.4. Asociación de resistencias con otros antibióticos 1.9.5. Factores clínicos asociados a la presencia de BLEEs 1.9.6. Tratamiento de las infecciones por bacterias productoras de BLEEs 1.9.7. Prevención y control 1.9.8. Métodos fenotípicos de detección de la presencia de BLEEs 1.9.8.1. Métodos de difusión con disco 1.9.8.2. Prueba de Epsilon (E-test) 1.9.8.3. Métodos automatizados 1.9.9. Métodos bioquímicos y moleculares para la caracterización de BLEEs 1.9.9.1. Isoelectroenfoque 1.9.9.2. Perfil de substrato 1.9.9.3. Cinética enzimática 1.9.9.4. Determinación de los IC 50 1.9.9.5. Sondas de DNA 40 40 43 45 47 49 51 63 76 80 81 86 90 92 95 96 97 98 98 99 99 99 1.9.9.6. Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 1.9.9.7. Electroforesis en campo pulsado 2. OBJETIVOS 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Selección de los aislados clínicos 3.2. Detección fenotípica de la presencia de BLEEs 3.2.1. Métodos de difusión con disco 3.2.2. Prueba de Epsilon (E-test) 3.2.3. Métodos automatizados 3.2.3.1. Sistema VITEK 2 3.2.3.2. Sistema WIDER 3.3. Métodos bioquímicos y moleculares para la caracterización de BLEEs 3.3.1. Isoelectroenfoque 3.3.1.1. Sonicación 3.3.1.2. Isoelectroenfoque 3.3.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 3.3.2.1. Extracción del ADN bacteriano 3.3.2.2. Amplificación del ADN bacteriano 3.3.2.3. Electroforesis en gel de agarosa 3.3.3. Electroforesis en gel por campo pulsado 3.3.3.1. Preparación del ADN bacteriano 3.3.3.2. Digestión con enzimas de restricción 100 100 103 107 109 111 113 116 118 118 121 124 124 125 126 127 129 129 130 131 131 133 3.3.3.3. Electroforesis en campo pulsado 3.4. Métodos estadísticos de análisis de los resultados 4. RESULTADOS 4.1. Descripción fenotípica y caracterización bioquímica y molecular de los aislados productores de BLEEs 4.2. Características demográficas de los aislados 4.3. Resultados obtenidos mediante el método de referencia (método A) 4.4. Resultados obtenidos mediante el método B 4.5. Resultados del estudio con cefepime y cefoxitina 4.6. Resultados obtenidos mediante la prueba de Epsilon 4.7. Resultados obtenidos mediante VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos estudiados 4.8. Resultados obtenidos mediante VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos estudiados 4.9. Resultados obtenidos mediante WIDER para los antibióticos betalactámicos estudiados 4.10. Evaluación de los diferentes métodos fenotípicos estudiados para la detección de BLEEs 4.11. Resultados del estudio de prevalencia 4.12. Resultados del estudio de clonalidad mediante electroforesis en campo pulsado 4.13. Resultados del análisis estadístico inferencial 4.13.1. Variables demográficas 4.13.2. Distribuciones de CMIs obtenidas mediante E- test en los aislados productores de BLEEs 133 134 137 140 164 172 175 178 181 199 229 247 275 285 286 287 287 288 4.13.3. Antibióticos betalactámicos estudiados mediante el sistema VITEK 2 4.13.4. Antibióticos no betalactámicos estudiados mediante el sistema VITEK 2 4.13.5. Antibióticos betalactámicos estudiados mediante el sistema WIDER 5. DISCUSIÓN 5.1. Métodos de difusión con disco 5.1.1. Método A 5.1.2. Método B 5.1.3. Difusión con disco con cefepime y cefoxitina 5.2. Estudio bioquímico y molecular de los aislados productores de BLEEs 5.3. Prueba de Epsilon 5.4. Resultados obtenidos mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos 5.4.1. Concentración mínima inhibitoria in vitro en los antibióticos betalactámicos 5.4.2. Categorías clínicas para los antibióticos betalactámicos 5.5. Resultados obtenidos mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos 5.6. Resultados obtenidos mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos 5.6.1. Concentración mínima inhibitoria in vitro en los antibióticos betalactámicos 289 295 300 307 311 313 316 318 319 321 323 324 331 332 336 337 5.6.2. Categorías clínicas para los antibióticos betalactámicos 5.7. Evaluación de métodos fenotípicos 5.7.1. Métodos de difusión con disco y prueba de Epsilon 5.7.2. Métodos automatizados 5.8. Epidemiología 5.9. Estudio de clonalidad 5.10.Opciones terapéuticas 6. CONCLUSIONES 7. BIBLIOGRAFÍA 342 344 347 354 361 367 368 373 379 1. INTRODUCCIÓN 1. Introducción 3 1.1. Mecanismo de acción de los antibióticos betalactámicos Los antibióticos betalactámicos (penicilinas, cefalosporinas, monobactámicos y carbapenémicos) son moléculas químicamente diversas que tienen en común la presencia de un anillo betalactámico (figura 1) en su estructura. Figura 1: Anillo betalactámico La similitud estereoquímica del anillo betalactámico con el dipéptido d-alanina-d-alanina (Tipper y Strominger, 1965) les permite interaccionar con diversas proteínas enzimáticas con actividad de transpeptidasas y carboxipeptidasas situadas en la superficie de la membrana plasmática bacteriana, moléculas encargadas de modelar la configuración definitiva de la capa del peptidoglucano, además de guiar su reorganización durante la división de las bacterias. A estas proteínas de membrana las conocemos genéricamente como proteínas fijadoras de penicilina (penicillin binding proteins o PBP) (Spratt, 1983). La actividad antibacteriana de los betalactámicos está, pues, en relación con su capacidad para interferir, de forma competitiva, en la actividad de las PBPs. Varias de estas enzimas han sido caracterizadas estructural y bioquímicamente. Las PBPs poseen pesos moleculares variables entre 120 kD en el caso de PBP-1 y 40 kD en el caso de PBP-6. El número NH O Betalactamasas de espectro extendido 4 total de PBPs por bacteria varía de una especie microbiana a otra, y es inversamente proporcional a su peso molecular. La función de cada una de las PBPs es distinta, y las consecuencias para la bacteria de su bloqueo, también. Así, PBP-1 actúa, fundamentalmente, como una transpeptidasa, dependiendo de ella la integridad estructural de la pared, ya que cuando se bloquean con penicilinas, aparecen esferoplastos y la célula se lisa. PBP-2 modula la forma bacteriana, así que, cuando se bloquea su actividad, provoca el desarrollo de células redondas que se lisan fácilmente. PBP-3 interviene en la división bacteriana, provocando, al bloquearse, la aparición de formas filamentosas sin septos. PBP-4, PBP-5 y PBP-6 tienen actividad carboxipeptidasa, e intervienen en la liberación del quinto aminoácido del pentapéptido, que es necesaria para la polimerización del peptidoglucano. La afinidad de los diferentes antibióticos betalactámicos por estas proteínas enzimáticas es variable. Así, por ejemplo, los carbapenémicos poseen mayor afinidad por PBP-2, PBP-1a y PBP-1b (Jones, 1985), transpeptidasas de cuya acción depende la integridad estructural de la pared hasta el punto que, cuando su actividad es anulada por estos antibióticos, las bacterias se convierten en esferoplastos, morfotipos que no resisten la presión osmótica y se rompen. Las aminopenicilinas tienen afinidad por PBP-2. Cefotaxima y aztreonam, entre otros, se fijan con elevada afinidad a PBP-3 (Costa y Botta, 1984), proteína que interviene en la división bacteriana. La acción bactericida de los antibióticos betalactámicos no está ligada directamente a la interferencia con la síntesis del peptidoglucano. El bloqueo de las PBPs permite la actuación de enzimas hidrolíticas (autolisinas endógenas) en las bacterias que disponen de ellas, y como consecuencia se produciría la lisis (Tomasz, 1979). Las bacterias que carecen de autolisinas son inhibidas, pero no destruidas. 1. Introducción 5 Para actuar, por tanto, los betalactámicos deben llegar a las PBPs. Eso es fácil en los microorganismos grampositivos, pero más difícil en gramnegativos y micobacterias. Por eso, en gramnegativos, deben aprovechar la presencia de poros proteicos (porinas). Además, la acción del betalactámico no es posible si la bacteria no se multiplica, porque ese es el momento de síntesis de la pared celular y de actuación de las PBPs. Es decir, actúan en fase de crecimiento exponencial. Betalactamasas de espectro extendido 6 1.2. Clasificación de los antibióticos betalactámicos En la tabla 1 se recogen los principales antibióticos betalactámicos de interés clínico. Tabla 1: Clasificación de los antibióticos betalactámicos Clase Tipos Antibióticos Bencilpenicilinas Bencilpenicilina procaína Bencilpenicilina benzatina Alquilpenicilinas Fenoximetilpenicilina benzatina Isoxazolpenicilinas Cloxacilin Aminopenicilinas Ampicilina / amoxicilina Penicilinas Ureidopenicilinas Piperacilina Sulfonas del ácido penicilánico Sulbactam Tazobactam Inhibidores de betalactamasas Oxapenamas o clavamas Ácido clavulánico Primera generación Cefazolina Cefalexina Segunda generación Cefonicid Cefuroxima Cefaclor Tercera generación Cefotaxima Ceftriaxona Ceftazidima Ceftizoxima Cefixima Cefpodoxima Ceftibuteno Cefalosporinas Cuarta generación Cefepime Cefpiroma Cefamicinas Cefalosporinas de 2ª generación parenterales Cefoxitina Monobactámicos o monobactamas Aztreonam Carbapenemas Imipenem 4-beta-metilcarbapenema Meropenem Carbapenémicos o carbapenemas 1-beta-metilcarbapenema Ertapenem 1. Introducción 7 1.3. Estructura química y actividad clínica de las penicilinas Las penicilinas son un grupo de antibióticos que contienen un anillo betalactámico y un anillo de tiazolidina, formando el ácido 6- aminopenicilánico, estructura que deriva de la condensación de una molécula de valina y una de cisteína para dar lugar al doble anillo característico. Además, tienen una cadena lateral, que varía de unas penicilinas a otras, en la posición 6 del anillo betalactámico y que es la que define sus propiedades. Las penicilinas pueden dividirse según su actividad antibacteriana. La clasificación de las penicilinas ha quedado reflejada en la tabla 1. 1.3.1. Bencilpenicilina o penicilina G Bencilpenicilina (figura 2) incluye en su espectro a la mayoría de los microorganismos grampositivos, tanto aerobios como anaerobios, cocos gramnegativos y algunos bacilos gramnegativos, aunque hay que considerar que los aislados productores de betalactamasas son resistentes a este antibiótico. La mayoría de las especies de estreptococos son sensibles, si bien se está produciendo un incremento de aislados resistentes, siendo especialmente importante, por su trascendencia clínica, el incremento de resistencia a la penicilina por S. pneumoniae. El género Staphylococcus spp. es generalmente sensible, si bien, aquellas cepas resistentes a meticilina o las que poseen betalactamasas, son resistentes a este antibiótico. El género Enterococcus spp. es, por lo general, más resistente que otros cocos grampositivos. Entre los microorganismos Betalactamasas de espectro extendido 8 gramnegativos sensibles se incluyen Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae, salvo las cepas con alteraciones de las PBPs, que presentan sensibilidad disminuída, y de las productoras de betalactamasas, que serán resistentes. Lo mismo ocurre con Haemophilus influenzae o Haemophilus ducreyi. Las espiroquetas (Treponema pallidum, Leptospira spp. y Borrelia spp.) son sensibles. Las enterobacterias, Rickettsia spp., Mycoplasma spp., Corynebacterium jeikeium y la mayoría de Nocardia spp. son resistentes. Es el antibiótico de elección en las infecciones producidas por Streptococcus pyogenes, neumococos (excepto cepas resistentes), enterococos, meningococos (salvo en la erradicación faríngea), gonococos y estafilococos no productores de betalactamasas (penicilinasas). Es el antibiótico de elección en las infecciones por Clostridium spp. Es útil en la profilaxis de la fiebre reumática y en el tratamiento de la endocarditis estreptocócica. Está indicada en infecciones por espiroquetas, actinomicosis, ántrax y difteria. Es útil en infecciones periodontales, angina de Vincent e infecciones pulmonares de origen orofaríngeo. No es útil en infecciones abdominales ni pélvicas, donde pueden estar presentes anaerobios gramnegativos resistentes como el género Bacteroides spp. Figura 2: Bencilpenicilina CH 3 CH 3 CO 2 H O O S H N N 1. Introducción 9 1.3.2. Fenoximetilpenicilina o penicilina V Su espectro y actividad son similares a los de bencilpenicilina, siendo también activa frente a estreptococos, aunque algo menos frente a estafilococos, H. influenzae, gonococos y meningococos. Se usa en el tratamiento de faringitis y en infecciones leves orales o de tejidos (figura 3). Figura 3: Fenoximetilpenicilina 1.3.3. Cloxacilina Cloxacilina (figura 4) presenta actividad frente a estafilococos, estreptococos, gonococos y anaerobios grampositivos. Los enterococos son parcialmente resistentes. H. influenzae es resistente. No es activa frente a bacilos gramnegativos. Su principal indicación terapéutica es el tratamiento de las infecciones producidas por Staphylococcus spp. no resistente. Figura 4: Cloxacilina CH 3 CH 3 CO 2 H O O S H N N O CH 3 CH 3 CO 2 H O O S H N N CH 3 O N Cl Betalactamasas de espectro extendido 10 1.3.4. Aminopenicilinas Son ligeramente más activas que bencilpenicilina frente a S. pyogenes, S. pneumoniae, S. agalactiae, enterococos, N. meningitidis y corinebacterias. Son más activas frente a L. monocytogenes, H. influenzae no productor de betalactamasas y algunos bacilos gramnegativos como Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp. o Proteus mirabilis no productores de betalactamasas plasmídicas. La mayoría de Klebsiella spp., Acinetobacter spp., Serratia spp., Proteus vulgaris, Pseudomonas spp. y Bacteroides del grupo fragilis, son resistentes a estas penicilinas (figura 5). Ampicilina Amoxicilina Figura 5: Aminopenicilinas El incremento de aislados productores de betalactamasas plasmídicas ha disminuido su utilidad clínica, por lo que se asocian a inhibidores de betalactamasas (ácido clavulánico o sulbactam). Son útiles en el tratamiento de infecciones del tracto urinario y respiratorias, en el tratamiento de endocarditis por enterococos, meningitis y en sepsis, sobretodo combinadas con aminoglucósidos. Amoxicilina también se usa en la eliminación de portadores de Salmonella typhi. CH 3 CH 3 CO 2 H O O S H N N NH 2 CH 3 CH 3 CO 2 H O O S H N N NH 2 HO 1. Introducción 11 1.3.5. Piperacilina Presenta una buena actividad frente a estreptococos, enterococos, estafilococos, H. influenzae y gonococos. Los aislados resistentes a penicilina por alteración en las PBPs son también sensibles a este antibiótico, pero los gonococos productores de betalactamasas son resistentes. Es la penicilina más activa frente a P. aeruginosa, P. fluorescens, B. cepacia y S. maltophilia. Es activa frente a la mayoría de especies de la familia Enterobacteriaceae, incluyendo Citrobacter spp., Enterobacter spp., Morganella spp., Providencia spp. y S. marcescens. Son sensibles Bacteroides del grupo fragilis y otros muchos anaerobios (figura 6). Es rápidamente hidrolizada por betalactamasas, de ahí que los aislados productores de éstas son resistentes, en especial aquellos que producen betalactamasas de tipo TEM y otras de codificación plasmídica. Sin embargo, su asociación con tazobactam mejora sensiblemente su actividad frente a este tipo de aislados. Esta asociación se muestra activa frente a S. aureus, H. influenzae, N. gonorrhoeae, E. coli, K. pneumoniae y Bacteroides del grupo fragilis resistentes a piperacilina, aunque esta asociación no mejora la actividad de piperacilina sola frente a P. aeruginosa. Figura 6: Piperacilina CH 3 CH 3 CO 2 H O O S H N N NO O N CH 3 Betalactamasas de espectro extendido 12 1.4. Estructura química y actividad clínica de los inhibidores de betalactamasas Estos antibióticos pueden clasificarse según su mecanismo de acción en competitivos, si el inhibidor y el substrato (amoxicilina, ampicilina, piperacilina) compiten por el lugar activo de la enzima, o no competitivo, si no se producen interferencias entre el inhibidor y el substrato, debido a que se unen a lugares diferentes de la enzima. A su vez, la inhibición puede ser reversible, si la enzima recupera su acción después de desligarse del inhibidor, ya que no tiene lugar ningún tipo de modificación química, o irreversible, si la enzima permanece inactiva incluso después de liberarse del inhibidor debido a que se produce una alteración química y conformacional. Un tipo particular de inhibición irreversible es la conocida como inhibición ?suicida?, en la cual el enzima queda covalentemente modificado e inactivo y el inhibidor se autodestruye. Los inhibidores suicidas (ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam) exhiben este tipo de cinética de inhibición, aunque en las primeras fases se comportan como inhibidores competitivos debido a la similitud estructural con las moléculas a que se asocian. Estructuralmente los inhibidores pueden ser betalactámicos o no betalactámicos, determinando, en último término, el carácter competitivo o no competitivo respectivamente, de la reacción (Bush y Sykes, 1983). Hasta el momento sólo se han introducido en clínica compuestos de estructura química betalactámica: ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam (figura 7). En los inhibidores de estructura betalactámica la cinética de inhibición es de tipo competitivo y la reacción que se produce entre el enzima y el inhibidor es, en esencia, igual a la que tiene lugar entre una betalactamasa y cualquier molécula con estructura betalactámica. 1. Introducción 13 Ácido clavulánico Sulbactam Tazobactam Figura 7: Inhibidores de betalactamasas Tanto ácido clavulánico como las sulfonas del ácido penicilánico, muestran una baja actividad antibacteriana frente a la mayoría de los microorganismos, por lo que como agentes únicos no son útiles clínicamente. Sólo se muestran sensibles a ácido clavulánico Legionella spp. y algunas cepas de M. catarrhalis, C. jejuni, N. gonorrhoeae y N. meningitidis. Algunos aislados de Neisseria spp., B. fragilis y Chlamydia trachomatis son sensibles a sulbactam, aunque el hecho más significativo es la buena actividad frente a Acinetobacter spp. Tazobactam, en comparación con los anteriores, muestra menor actividad intrínseca frente a enterobacterias y bacilos gramnegativos no fermentadores. N. O N O OH O OH O N S O OH O O CH 3 CH 3 O N S O OH O O CH 3 N N N Betalactamasas de espectro extendido 14 gonorrhoeae, N. meningitidis, M. catarrhalis y Acinetobacter spp. son moderadamente sensibles in vitro. Aunque son posibles otras combinaciones, el ácido clavulánico se encuentra disponible asociado a amoxicilina, sulbactam asociado a ampicilina y tazobactam a piperacilina. La resistencia a las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas puede aparecer por alteraciones de la permeabilidad (Reguera et al., 1991), inducción de enzimas tipo OXA (Zhou et al., 1994), o por hiperproducción de betalactamasas cromosómicas o plasmídicas normalmente sensibles a la inhibición (Martínez et al., 1989). Éste último es el mecanismo de resistencia más frecuente, que supone una disminución de la sensibilidad de microorganismos previamente sensibles, ya que al aumentar la cantidad de enzima parte de ellas escapan a la acción del inhibidor e hidrolizan el antibiótico asociado. La sensibilidad podría ser restaurada incrementando la cantidad de inhibidor. La asociación con ácido clavulánico supone la recuperación de la actividad de amoxicilina frente a microorganismos de las especies productoras de betalactamasas y la amplía a bacterias resistentes por producción natural de enzimas (P. vulgaris, Klebsiella spp., P. pseudomallei, Aeromonas spp., B. fragilis, C. jejuni, H. influenzae). La asociación con sulbactam supone las mismas ventajas que para el caso del ácido clavulánico, pero hay que tener en cuenta la menor capacidad de sulbactam para inhibir las betalactamasas tipo TEM y SHV. Por otra parte, frente a Acinetobacter spp. únicamente es activa la asociación ampicilina-sulbactam, debido a la mayor afinidad de éste último por PBP-2 (Gales et al., 1996). La asociación con tazobactam restablece la actividad de piperacilina frente a especies productoras de betalactamasas como E. coli, Klebsiella spp., M. morganii, P. vulgaris, C. diversus, y es la asociación 1. Introducción 15 betalactámico-inhibidor de betalactamasas más efectiva frente al grupo de B. fragilis (Gobernado et al., 1998). Las indicaciones de la combinación amoxicilina-ácido clavulánico incluyen las infecciones del aparato respiratorio, tanto superior como inferior, del tracto urinario, infecciones obstetroginecológicas, infecciones de piel, tejidos blandos y osteoarticulares, infecciones odontógenas y periodontales. Las indicaciones de ampicilina-sulbactam son similares a las anteriores, además de las infecciones graves por Acinetobacter spp. multirresistentes, en las que ésta puede ser una de las escasas opciones terapéuticas. Por su parte, piperacilina-tazobactam está indicada en el tratamiento de infecciones polimicrobianas graves o producidas por microorganismos resistentes a otros antibióticos: bacteriemias, infecciones intraabdominales, ginecológicas y neumonías graves adquiridas en la comunidad, en las que se sospeche la presencia de P. aeruginosa, y en las nosocomiales. Betalactamasas de espectro extendido 16 1.5. Estructura química y actividad clínica de las cefalosporinas Las cefalosporinas son fármacos cuya estructura básica está constituída por el anillo 7-aminocefalosporánico (figura 8), que consiste en la fusión de un anillo dihidrotiacínico y un anillo betalactámico. La introducción de modificaciones en las cadenas laterales de este anillo origina las diversas cefalosporinas (figura 9). Figura 8: Anillo 7-aminocefalosporánico Cefazolina (1ª generación) Cefuroxima (2ª generación) Cefotaxima (3ª generación) Cefepime (4ª generación) Figura 9: Cefalosporinas representativas de cada grupo COO R H H S N O HH R 1 -NH S S CH 3 N - N OHO N S O O H N N N N N O NH 2 OHO N S O O H N O O N O CH 3 O CH 3 OHO N S O O H N O N N OCH 3 S NH 2 O 1- O N S O O H N N N OCH 3 S NH 2 N + CH 3 1. Introducción 17 1.5.1. Cefalosporinas de primera generación Las cefalosporinas de primera generación son las que mantienen una mejor actividad frente a microorganismos grampositivos, con la excepción de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM), de los neumococos resistentes a penicilina y de los enterococos, resistentes de forma intrínseca a cefalosporinas. Mantienen una buena actividad frente a las enterobacterias más sensibles (E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis) y frente a Neisseria spp., incluídas cepas con alteraciones de las PBPs, pero no frente a productoras de betalactamasas (todas ellas resisten en buena medida la acción de las betalactamasas de S. aureus, pero son hidrolizadas eficazmente por la mayoría de betalactamasas de otros tipos). Tienen una actividad de moderada a pobre frente a anaerobios, siendo activas principalmente frente a anaerobios grampositivos, con resistencia generalizada en el grupo de B. fragilis. Actualmente, el desarrollo de nuevos fármacos, tanto cefalosporinas, como de otros grupos, ha limitado bastante sus aplicaciones, de modo que éstas se reducen, en buena parte, a procesos no complicados de adquisición extrahospitalaria, causados por microorganismos presuntamente sensibles. Se usan fundamentalmente en infecciones del tracto urinario no complicadas, faringoamigdalitis y neumonía neumocócica adquirida en la comunidad en áreas con baja incidencia de resistencia a penicilina, y en infecciones leves a moderadas de piel y tejidos blandos. Son también útiles en profilaxis quirúrgica, fundamentalmente en intervenciones traumatológicas y en implantación de prótesis, en las que se pretende evitar sobretodo las infecciones por grampositivos. Betalactamasas de espectro extendido 18 1.5.2. Cefalosporinas de segunda generación La segunda generación mejora, tanto en espectro frente a bacterias gramnegativas, como en actividad intrínseca, respecto a las de primera generación, aunque a costa de una cierta pérdida de actividad frente a bacterias grampositivas. En este grupo el aumento de espectro y la mayor actividad antimicrobiana, junto con la mayor disponibilidad de fármacos orales, incrementan de forma notable el número de procesos en que son potencialmente útiles, tanto en el hospital como, sobretodo, en el ámbito extrahospitalario. Sin embargo, son muy pocas las infecciones en que alguna de estas cefalosporinas puede ser considerada como tratamiento de elección. Son, prácticamente en todos los casos, una alternativa más junto con otros fármacos, betalactámicos o no. Gracias a su actividad frente a microorganismos grampositivos, especialmente estreptococos, y frente a Haemophilus spp., Neisseria spp., y Moraxella spp., son una alternativa en el tratamiento de diversos procesos otorrinolaringológicos (faringoamigdalitis, otitis, sinusitis), agudizaciones de origen infeccioso de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y otro tipo de infecciones respiratorias, infecciones del tracto urinario, gonococia, y en el caso de cefuroxima, meningitis, aunque actualmente haya sido desplazada por las cefalosporinas de tercera generación con mejores resultados. Pueden ser útiles, además, como profilaxis quirúrgica en cirugía colorrectal y ginecológica. Las cefamicinas (cefoxitina), dado su espectro, son antibióticos adecuados en infecciones mixtas por microorganismos aerobios y anaerobios (infecciones intraabdominales, enfermedad inflamatoria pélvica y otras infecciones ginecológicas, pie diabético, celulitis secundarias a úlceras de decúbito y, en general, otras infecciones de 1. Introducción 19 partes blandas en que se sospeche flora mixta). Sin embargo, no son muy recomendables en procesos graves, en los que quizá sean preferibles fármacos con mayor margen de seguridad frente a anaerobios (asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas, carbapenemas, metronidazol), y en cuadros de adquisición nosocomial, en los que puede ser preferible la administración de agentes más activos frente a enterobacterias de forma individual (carbapenemas) o en asociación (cefalosporinas de tercera generación o aminoglucósidos más un anaerobicida). 1.5.3. Cefalosporinas de tercera generación Las cefalosporinas de tercera generación incrementan notablemente el espectro, la actividad y la resistencia a la hidrólisis por la mayor parte de las betalactamasas, e introducen algunas características farmacocinéticas interesantes como es su buen acceso al líquido cefalorraquídeo. Las cefalosporinas de tercera generación se muestran muy activas frente a todos los cocos y bacilos gramnegativos incluídos ya en el espectro de las generaciones anteriores (Neisseria spp., Moraxella spp., Haemophilus spp., E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp.) y amplían su espectro a especies defectuosamente cubiertas por las generaciones previas, como Morganella spp., Providencia spp., Serratia spp. y Citrobacter spp. Se muestran además activas frente a neumococos moderadamente resistentes a penicilina y otros estreptococos, pero pierden actividad en comparación con las generaciones precedentes frente a estafilococos. Su actividad frente a anaerobios es escasa y respecto a P. aeruginosa hay que diferenciar dos grandes grupos: uno sin apenas eficacia frente a esta especie, que incluye moléculas como cefotaxima, ceftriaxona, ceftizoxima, cefixima, cefpodoxima y Betalactamasas de espectro extendido 20 ceftibuteno, y otro con excelente actividad antipseudomónica como ceftazidima o cefoperazona. Todas ellas son ineficaces frente a estafilococos meticilin resistentes y enterococos, y tienen una actividad irregular frente a Acinetobacter spp. y géneros próximos a las pseudomonas, como Stenotrophomonas spp. y Burkholderia spp. Cefotaxima es una aminotiazol-metoxi-imino cefalosporina con excelente actividad frente a enterobacterias, con las excepciones de las cepas productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEEs) y aquellas con producción desreprimida de cefalosporinasas. Se muestra además muy activa frente a estreptococos, pero presenta escasa actividad sobre estafilococos y anaerobios. Tiene una hemivida de una hora, lo que permite dosificarla cada seis. No obstante, en el curso de su metabolismo diversas esterasas hepáticas actúan sobre el grupo acetoxi-metil presente en posición 3, dando lugar a desacetilcefotaxima, con menor actividad intrínseca que cefotaxima, pero con actividad sinérgica, potenciando su acción. Tal circunstancia puede permitir su dosificación cada 8 horas en infecciones no graves. Consigue una buena distribución en los tejidos y penetra bien en el líquido cefalorraquídeo, de modo que, a dosis altas, logra concentraciones que llegan a superar los 40 mg/l, y dada su excelente actividad frente a los patógenos meníngeos habituales, la convierte, junto con otras cefalosporinas de tercera generación, en un fármaco de elección en el tratamiento de la meningitis bacteriana. Su excreción es fundamentalmente urinaria, eliminándose la mayor parte del fármaco en forma de desacetilcefotaxima. Sus efectos secundarios, escasos y habitualmente leves, se reducen a los comunes a todas las cefalosporinas, así como a la posibilidad, por su amplio espectro, de sobreinfecciones por microorganismos resistentes, como levaduras, enterococos o P. aeruginosa, así como casos de colitis pseudomembranosa. Estos efectos 1. Introducción 21 son, por otra parte, comunes a todas las cefalosporinas de tercera generación. Cefpodoxima es también una aminotiazol-metoxi-imino cefalosporina administrada en forma de éster. Se trata de un éster propil- carbonil-oxietil (proxzetilo) en posición 4, diferenciándose de la anterior sólamente por su radical metoximetil en posición 3. Ceftazidima es una aminotiazol-carboxi-propil-oxiimino cefalosporina, dotada de un grupo l-piridinio con un amonio cuaternario en posición 3. Esto la convierte en una molécula dianiónica, donde la carga negativa del núcleo cefema es compensada por la carga positiva del grupo piridinio, quedando con una carga neta aniónica correspondiente al carboxilo del grupo carboximetil-oxiimino. Ceftazidima es prácticamente inactiva frente a grampositivos y anaerobios, pero en cambio es muy activa frente a gramnegativos, incluídos enterobacterias resistentes, P. aeruginosa y especies afines y Acinetobacter spp., debido a su baja afinidad por las betalactamasas y su baja capacidad de inducción. Tiene una hemivida próxima a las dos horas, que permite dosificaciones cada ocho, y penetra en el líquido cefalorraquídeo. Penetra bien en los tejidos y se excreta fundamentalmente por vía urinaria. Las cefalosporinas de tercera generación antipseudomónicas, sobretodo ceftazidima, son una alternativa en cuadros en que la etiología por Pseudomonas spp. sea segura o probable, como las infecciones respiratorias en pacientes con fibrosis quística. Las cefalosporinas de tercera generación constituyen un pilar fundamental de la terapéutica antimicrobiana, sobretodo en el ámbito hospitalario, donde tienen numerosas aplicaciones: infecciones respiratorias de adquisición nosocomial, ITU complicada, infecciones de piel y tejidos blandos de adquisición nosocomial, infecciones en inmunodeprimidos, etc. En todos estos casos, no obstante, ante la proliferación de infecciones hospitalarias por microorganismos Betalactamasas de espectro extendido 22 potencialmente resistentes a cefalosporinas de tercera generación (cepas productoras desreprimidas de cefalosporinasas, P. aeruginosa y especies afines, cepas productoras de BLEEs...), puede ser recomendable no utilizarlas de forma aislada sino en asociación con otros fármacos, como aminoglucósidos. Se hallan incluídos en la mayoría de los protocolos de tratamiento empírico de los pacientes neutropénicos febriles, habitualmente con un aminoglucósido. Su empleo correcto fuera del hospital debería ser, en cambio, limitado, reduciéndose en la práctica al tratamiento de algunos cuadros específicos (gonococia, chancro blando, enfermedad de Lyme avanzada...) y a la terapia secuencial de cuadros tratados inicialmente en el hospital. Actualmente, su uso desmesurado está favoreciendo la proliferación, a nivel comunitario, de importantes mecanismos de resistencia como las betalactamasas de espectro extendido. 1.5.4 Cefalosporinas de cuarta generación Son moléculas básicamente semejantes a las cefalosporinas de tercera generación, como cefotaxima, en las que la presencia de un grupo no cargado en posición 7, y la introducción de radicales con carga positiva en posición 3, que compensan la carga negativa correspondiente al grupo carboxilo en posición 2, da lugar a moléculas con una carga eléctrica neta nula. Ésta es una estructura que mejora notablemente su penetración a través de la pared bacteriana. En conjunto, se trata de cefalosporinas que mejoran de forma notable la actividad de las de tercera generación frente a estafilococos sensibles a meticilina, neumococos y otros estreptococos patógenos. Algunas de ellas se comercializaron como activas frente a enterococos, pero estudios posteriores no demostraron dicha actividad (Gutiérrez et 1. Introducción 23 al., 1996). Su actividad sobre los bacilos gramnegativos productores de betalactamasas plasmídicas clásicas (E. coli, P. mirabilis, K. pneumoniae, Salmonella spp.) es similar a la de las cefalosporinas de tercera generación, pero frente a especies productoras de cefalosporinasas cromosómicas inducibles o desreprimidas (E. cloacae, S. marcescens, C. freundii) y frente a P. aeruginosa es mejor, con la excepción, en algunos casos, de ceftazidima. Son activas, in vitro, frente a aislados productores de algunas betalactamasas de espectro extendido. Su actividad frente a anaerobios es limitada. Sus principales indicaciones serían la neumonía nosocomial, en especial en áreas problemáticas (UCIs, unidades de quemados, hematología, etc.), episodios febriles en neutropénicos y cuadros sépticos de adquisición nosocomial, debido a la frecuente multirresistencia de los agentes etiológicos cuando las infecciones son de adquisición intrahospitalaria. También pueden estar indicadas en infecciones del tracto urinario nosocomiales complicadas, infecciones polimicrobianas de piel y tejidos blandos cuando están implicados estafilococos sensibles a meticilina y bacilos gramnegativos, y en infecciones intraabdominales, siempre combinados con un agente eficaz frente a anaerobios. Betalactamasas de espectro extendido 24 1.6. Estructura química y actividad clínica de los antibióticos monobactámicos Los antibióticos monobactámicos son derivados del ácido 3- aminomonobactámico (3-AMA). Tienen una estructura betalactámica sencilla, con una estructura monocíclica en la que el anillo betalactámico no está fusionado a otro secundario (figura 10). Figura 10: Anillo monobactámico El fármaco representativo de este grupo es aztreonam. Éste tiene un mecanismo de acción similar al del resto de los antibióticos betalactámicos: tiene que pasar a través de las porinas proteicas de la pared celular bacteriana, resistir a la hidrólisis de las betalactamasas del espacio periplásmico y ejercer su acción uniéndose a las PBPs, principalmente a PBP-3 y a PBP-1a, a las que inhibe, produciendo directamente la lisis de la bacteria (es un antibiótico bactericida). Aztreonam es muy sensible a la hidrólisis por las betalactamasas bacterianas, tanto las codificadas por plásmidos tipo TEM-1, TEM-2, OXA-2, OXA-3, PSE-1, PSE-3, PSE-4 y SHV-1, como a las determinadas por el cromosoma. Es poco inductor de betalactamasas, incluídas las de Pseudomonas spp., lo que es importante desde el punto de vista de la aparición de resistencias. N O SO 3 HH CH 3 R-NH 1. Introducción 25 Aztreonam tiene una excelente actividad, semejante o superior a la de los aminoglucósidos y las cefalosporinas de tercera y cuarta generación, centrándose específicamente sobre bacterias aerobias gramnegativas. Su espectro de actividad abarca principalmente a E. coli, S. marcescens, Proteus spp., Salmonella spp., Providencia spp, P. aeruginosa, Neisseria spp. o H. influenzae. No tiene actividad sobre las bacterias grampositivas aerobias ni sobre anaerobios, tanto grampositivos como gramnegativos. La administración conjunta de aztreonam con penicilinas, cefalosporinas, aminoglucósidos, fosfomicina, clindamicina, eritromicina, vancomicina o metronidazol, ha demostrado que produce un efecto aditivo o sinérgico. Este sinergismo tiene aplicaciones clínicas para tratar infecciones mixtas en las que una parte de los microorganismos causantes no puedan cubrirse con aztreonam, o para tratamientos empíricos iniciales. También hay actividad sinérgica de aztreonam con cefepime, mejorando la actividad de esta cefalosporina frente a P. aeruginosa al inhibir a las cefalosporinasas extracelulares. No es aconsejable asociar aztreonam con cefoxitina ni carbapenémicos debido a la capacidad de éstos para inducir betalactamasas cromosómicas en Pseudomonas spp., Serratia spp., Providencia spp., Enterobacter spp. y algunos Proteus spp. Betalactamasas de espectro extendido 26 1.7. Estructura química y actividad clínica de los antibióticos carbapenémicos Los antibióticos carbapenémicos (figura 11) son los antibióticos betalactámicos que presentan mayor espectro y actividad. Actúan como otros betalactámicos, uniéndose covalentemente a las PBPs, inhibiendo la síntesis de la pared celular y activando autolisinas endógenas, con lo cual la célula muere rápidamente. Debido a su bajo peso molecular y su estructura hidrofílica deben penetrar en las bacterias gramnegativas a través de porinas. Su acción se facilita por la estabilidad frente a un gran número de betalactamasas, tanto de microorganismos grampositivos, como de gramnegativos, cromosómicas o plasmídicas, aunque existen bacterias capaces de hidrolizarlos. Son potentes inductores de betalactamasas de tipo C en enterobacterias y P. aeruginosa, aunque habitualmente no producen desrepresión. Puede aparecer resistencia a estos antibióticos por alteraciones de la permeabilidad, por expulsión activa, por modificación de PBPs o por inactivación por betalactamasas (carbapenemasas). El primero de estos mecanismos aparece en bacterias gramnegativas por alteraciones en la membrana externa, en P. aeruginosa por disminución de la porina OprD o hiperproducción de OprM, que afecta más a meropenem, en E. cloacae y E. aerogenes por modificaciones en OmpF y OmpD asociadas a hiperproducción de betalactamasas tipo C que incrementa la CMI de meropenem y en menor medida las de imipenem. La expulsión activa aparece ligada al operón mexA-mexB-oprM que afecta sobretodo a meropenem y a otros betalactámicos, tetraciclinas, cloranfenicol y quinolonas, confiriendo multirresistencia en P. aeruginosa. Las modificaciones de las PBPs son el principal mecanismo de resistencia a estos antibióticos en bacterias grampositivas (S. aureus meticilin 1. Introducción 27 resistente asociado a PBP-2a, E. faecium, E. faecalis o L. monocytogenes); es un mecanismo raro en bacterias gramnegativas aunque puede aparecer en P. mirabilis (PBP-2 y PBP-1a), P. aeruginosa y A. baumannii. Son los antibióticos betalactámicos más estables a la hidrólisis por betalactamasas, siendo resistentes a la acción de la mayoría de estas enzimas. Imipenem Meropenem Ertapenem Figura 11: Principales antibióticos carbapenémicos Poseen un espectro de actividad muy amplio. In vitro son activos frente a bacterias grampositivas (S. aureus, estafilococos coagulasa negativos, S. agalactiae, S. pyogenes, S. pneumoniae, E. faecalis, L. monocytogenes, Corynebacterium spp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Bacillus spp.), frente a bacterias gramnegativas (Neisseria spp., Moraxella spp., enterobacterias, P. aeruginosa, Acinetobacter spp., Haemophilus spp., Brucella spp., Campylobacter spp., Helycobacter pylori, L. pneumophila) y bacterias anaerobias. Deben emplearse en infecciones graves y nosocomiales, sobretodo si hay posibilidad de que estén producidas por bacterias multirresistentes o polimicrobianas. No son antibióticos de elección en infecciones leves ni en profilaxis quirúrgica. Pueden usarse como tratamiento empírico en pacientes neutropénicos febriles, siendo más últil meropenem en monoterapia por su mayor actividad frente a P. aeruginosa, en bacteriemias y septicemias de origen desconocido, en infecciones intraabdominales, en neumonías nosocomiales, en meningitis (sólo cuando se sopeche la presencia de bacilos gramnegativos resistentes N S O O OH OH H CH 3 H CH 3 N CH 3 CH 3 NH O N H N NH S O O OH OH H CH 3 N S O COO - OH H CH 3 H CH 3 NH CO 2 Na NH 2 O Betalactamasas de espectro extendido 28 a otros antibióticos), en infecciones de tejidos blandos y osteoarticulares, en infecciones graves y complicadas del tracto urinario. Son especialmente útiles en infecciones por Acinetobacter spp., como endocardititis o neumonía. La asociación de imipenem con aminoglucósidos presenta diversos grados de sinergismo sobre enterobacterias, P. aeruginosa, Acinetobacter spp., enterococos, L. monocytogenes o S. aureus. Se ha descrito sinergismo entre este carbapenémico y ciprofloxacino en Enterobacter spp., y P. aeruginosa. Imipenem asociado con cefalosporinas puede actuar sinérgicamente sobre S. aureus resistente a meticilina y de la misma manera se puede comportar con vancomicina. También se ha demostrado sinergia con amikacina en Mycobacterium tuberculosis y E. faecalis. La asociación de imipenem con tetraciclinas y eritromicina es antagónica. Lo mismo ocurre cuando se asocia con otros betalactámicos frente a P. aeruginosa, S. marcescens, K. pneumoniae y M. morganii, probablemente por existir una potente inducción de betalactamasas por parte de imipenem. Por ello no es recomendable combinarlo con otros betalactámicos, ya que la inducción de betalactamasas puede disminuir la eficacia de cefalosporinas y penicilinas. Meropenem presenta una acción sinérgica con teicoplanina, vancomicina y piperacilina frente a S. aureus resistente a meticilina. Con vancomicina, y especialmente con teicoplanina, puede ser sinérgico sobre S. aureus y estafilococos coagulasa negativos sensibles y resistentes a meticilina. Su asociación con ampicilina o cefazolina frente a S. aureus resistente a meticilina reduce las CMIs de los otros betalactámicos. La asociación de meropenem, teicoplanina y gentamicina tiene un fuerte sinergismo frente a enterococos con grados moderados y altos de resistencia a gentamicina. 1. Introducción 29 1.8. Inactivación enzimática de los antibióticos betalactámicos por betalactamasas Las betalactamasas son enzimas que hidrolizan el enlace amida del anillo betalactámico de penicilinas, cefalosporinas y otros betalactámicos, perdiendo capacidad de unión a las PBPs, y dando así lugar a compuestos sin actividad antibacteriana. Desde un punto de vista clínico es esencial conocer la identidad del microorganismo que produce la betalactamasa, la localización del gen productor del enzima (plásmido o cromosoma), el carácter inducible o constitutivo de su expresión y el fenotipo de resistencia que determina (capacidad que tienen para hidrolizar los diferentes substratos betalactámicos y la mayor o menor inhibición de la que son objeto por parte de los inhibidores de betalactamasas). Estas características, así como el punto isoeléctrico y el peso molecular, se han empleado en la clasificación de las diferentes betalactamasas. También es necesario conocer la secuencia de aminoácidos, sobretodo la de su centro activo. Según éste existen cuatro clases de enzimas: A, B, C, y D (Ambler, 1980). Las enzimas de clase A, C y D poseen serina en su centro activo, que reacciona con el anillo betalactámico, abriéndolo irreversiblemente e inactivando el antibiótico; mientras que las enzimas de clase B poseen Zinc en su centro activo (metalobetalactamasas), que reacciona con el grupo carbonil del enlace amida del betalactámico inactivándolo (Samaha-Kfoury y Araj, 2003). En la actualidad las betalactamasas se clasifican según la propuesta de Bush, Jacoby y Medeiros (Bush et al., 1995) que unifican criterios de clasificaciones anteriores (tabla 2). Betalactamasas de espectro extendido 30 Tabla 2: Clasificación de las betalactamasas (modificada de Bush et al., 1995) Grupo Clase Substrato preferido Inhibi- do por ácido clavulá- nico Inhibi- do por EDTA Genes Enzimas Microorganis- mo 1 C Cefalosporinas - - Crom Plas Amp C MIR-1, MOX-1, FOX-1 Enterobacterias P. aeruginosa E. coli K. pneumoniae 2a A Penicilinas + - Crom / Plas S. aureus (A, B, C, D) S. aureus 2b A Penicilinas Cefalosporinas 1ª + - Plas TEM-1, TEM-2, SHV-1 Enterobacterias H. influenzae N. gonorrhoeae P. aeruginosa 2be A Penicilinas Cefalosporinas 1ª a 3ª Monobactámicos + - Plas Crom TEM 3-29, 43, 44, 50, 51, 52 SHV-2 a 10, 12 SHV-1 K1 K. oxytoca Enterobacterias P. aeruginosa K. pneumoniae K. oxytoca 2br A Penicilinas Inhibidores betalactamasas + / - - Plas TEM-30 a 42, 45 Enterobacterias 2c A Penicilinas Carbenicilina + - Plas PSE-1, 3, 4 Enterobacterias P. aeruginosa 2d D Penicilinas Cloxacilina + / - - Plas OXA-1 a 10 Enterobacterias P. aeruginosa 2de D Penicilinas Cloxacilina Cefalosporinas 1ª a 3ª + / - - Plas OXA 11 a 21 P. aeruginosa 2e A Cefalosporinas 1ª a 3ª + - Crom Cefuroximasa P. vulgaris 2f A Penicilinas Cefalosporinas 1ª a 3ª Carbapenemas + - Crom NMC-A Sme-1 IMI-1 E. cloacae S. marcescens 3 B Penicilinas Cefalosporinas 1ª a 3ª Carbapenemas - + Crom Crom / Plas Plas L-1 CcrA IMP-1 S. maltophilia B. fragilis Enterobacterias P. aeruginosa 4 Penicilinas - ? Crom Plas Nd SAR-2 B. cepacia E. coli 1. Introducción 31 A continuación se exponen las características más importantes de los distintos grupos de betalactamasas. Grupo 1: ƒ Según su secuencia de aminoácidos pertenecen a la clase C. ƒ Hidrolizan cefalosporinas. ƒ Presentan un residuo de serina en el centro activo. ƒ No se inhiben por ácido clavulánico. ƒ Incluye: ™ Betalactamasas cromosómicas inducibles (AmpC) de Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Morganella spp., y P. aeruginosa. ™ Betalactamasas cromosómicas constitutivas (AmpC) de E. coli. ™ Betalactamasas plasmídicas (MIR-1, MOX-1, FOX-1) de P. aeruginosa, E. coli y K. pneumoniae, que son el resultado de la incorporación de genes cromosómicos (ampC) en plásmidos. Grupo 2: ƒ Según su secuencia de aminoácidos pertenecen a las clases A o D. ƒ Todas presentan un residuo de serina en el centro activo. ƒ Se inhiben por ácido clavulánico. ƒ Incluye: ™ Penicilinasas cromosómicas y plasmídicas de bacterias grampositivas (Staphylococcus spp., Bacillus spp., Streptomyces spp., Enterococcus spp.). ™ Betalactamasas plasmídicas clásicas (TEM-1, TEM-2, SHV-1) de Enterobacteriaceae. Betalactamasas de espectro extendido 32 ™ Betalactamasas plasmídicas de espectro extendido u oxiiminobetalactamasas de Enterobacteriaceae (por modificación del centro activo de TEM-1, TEM-2 y SHV-1). ™ Betalactamasas derivadas de TEM que confieren resistencia a los inhibidores de betalactamasas o enzimas IRT de Enterobacteriaceae. ™ Betalactamasas cromosómicas constitutivas de K. pneumoniae (SHV-1) y K. oxytoca (K1). ™ Betalactamasas cromosómicas inducibles de P. vulgaris (o cefuroximasa). ™ Oxacilinasas clásicas plasmídicas de P. aeruginosa. ™ Oxacilinasas de espectro extendido plasmídicas de P. aeruginosa y Acinetobacter spp. (por cambios en el centro activo de OXA 1 a 10). ™ Carbapenemasas cromosómicas de E. cloacae, S. marcescens y P. aeruginosa. Grupo 3: ƒ Según su secuencia de aminoácidos y la presencia de Zinc pertenecen a la clase B (metalobetalactamasas). ƒ Hidrolizan penicilinas, cefalosporinas y carbapenemas. ƒ No se inhiben por ácido clavulánico. ƒ Incluye: ™ Betalactamasas cromosómicas de S. maltophilia. ™ Betalactamasas plasmídicas IMP de P. aeruginosa, S. marcescens y K. pneumoniae. Grupo 4: Son penicilinasas no inhibidas por ácido clavulánico y cuya caracterización molecular final está aún por realizar. 1. Introducción 33 1.8.1. Betalactamasas cromosómicas Casi todas las bacterias gramnegativas sintetizan una betalactamasa cromosómica, generalmente en muy poca cantidad, no confiriendo resistencia. Algunas de ellas, como E. coli, pueden incrementar de forma constitutiva la síntesis de esta enzima, AmpC, y, según su grado de expresión, se puede producir resistencia a todas las penicilinas, cefalosporinas de primera y segunda generación (incluída cefoxitina), algunas de tercera generación como ceftazidima y pérdida de sensibilidad a las asociaciones con inhibidores de betalactamasas, mientras que permanecen sensibles cefalosporinas de cuarta generación y carbapenemas (Livermore, 1995). La expresión de la betalactamasa cromosómica AmpC en otras enterobacterias como Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Morganella spp. y P. aeruginosa es, sin embargo, de carácter inducible (Sanders, 1987). Este proceso de inducción por el cual se incrementa la síntesis de la enzima cuando la bacteria está en presencia del antibiótico inductor es un fenómeno reversible que desaparece cuando éste no está presente (Bennett y Chopra, 1993). En este último grupo de microorganismos, además, se pueden producir fenómenos de desrepresión, que también incrementan la cantidad de betalactamasa. A diferencia de la inducción, la desrepresión es un fenómeno irreversible, que no desaparece cuando la bacteria no está en presencia del antibiótico selector, sino que se seleccionan mutantes establemente desreprimidos que sintetizan gran cantidad de enzima. Este proceso genera resistencia a las carboxi, acilamino y ureidopenicilinas y a las cefalosporinas de tercera generación (Livermore, 1995). Las cefalosporinas de tercera generación son buenos antibióticos selectores, pero malos inductores, de la producción de betalactamasas. Betalactamasas de espectro extendido 34 Por el contrario, carbapenémicos, cefamicinas e inhibidores de betalactamasas poseen un fuerte carácter inductor y baja capacidad de selección de mutantes establemente desreprimidos. Desde un punto de vista clínico el fenómeno de la desrepresión puede suponer un fracaso terapéutico, que puede desarrollarse durante el tratamiento con betalactámicos (Livermore, 1987). En algunos hospitales, más del 30% de los aislamientos de Enterobacter spp. y P. aeruginosa pueden hiperproducir la betalactamasa AmpC. Por ello, en el tratamiento de las infecciones producidas por microorganismos con betalactamasas cromosómicas inducibles se recurre a la administración de antibióticos betalactámicos poco selectores como carbapenemas o cefalosporinas de cuarta generación, que presentan menor tasa de hidrólisis por estas enzimas, y un bajo carácter selector, o a la administración simultánea de un antibiótico betalactámico con un aminoglucósido. El carácter inducible de estas enzimas es fácilmente detectable en los antibiogramas realizados mediante la técnica de difusión: cuando se disponen los discos de cefoxitina o imipenem próximos a los de las cefalosporinas de tercera o cuarta generación puede observarse un antagonismo entre ambos antibióticos, resultado de la inducción en la producción de betalactamasas que ejercen los primeros (Navarro et al., 2002). Sin embargo, ambos procesos son complejos y requieren la presencia del betalactámico y de, al menos, cinco genes en la bacteria: ampC, ampR, ampD, ampG y ampE (Sanders, 1987). El mecanismo de inducción de la betalactamasa AmpC depende del gen ampR que actúa como activador durante el proceso de inducción y como represor en condiciones normales. Los genes ampG y ampE determinan la formación de proteínas de membrana (AmpG y AmpE, respectivamente) y ampD da lugar a una proteína soluble (AmpD) que se libera en el citoplasma, 1. Introducción 35 donde favorece el reciclado de la pared celular y la síntesis del peptidoglucano a partir de los productos de degradación de la pared. En presencia de un antibiótico betalactámico inductor, AmpG actúa como permeasa y facilita la entrada en el citoplasma de los productos de degradación del peptidoglucano que se están produciendo como consecuencia del proceso de actuación del antibiótico betalactámico. Estos productos participan en la conversión de ampR de represor a activador de ampC. En ausencia del betalactámico inductor no se liberan grandes cantidades de productos de degradación del peptidoglucano, circunstancia que impide finalmente la activación de AmpR. La participación de AmpE en todo este proceso no está claramente demostrada. Por su parte, los mutantes establemente desreprimidos no expresan el gen ampD, por lo que todo producto de degradación del peptidoglucano que se produce actúa como activador de ampR, liberándose siempre gran cantidad de betalactamasa AmpC. Como se ha indicado con anterioridad, AmpC de E. coli se expresa de forma constitutiva. Esta peculiaridad se debe a la ausencia de ampR en la dotación genética, por lo que tampoco se produce activación en presencia de antibióticos inductores. En ningún caso la enzima cromosómica AmpC es sensible a la acción de los inhibidores clásicos de betalactamasas. Por el contrario, las betalactamasas de Klebsiella spp. y P. vulgaris son sensibles al ácido clavulánico y otros inhibidores de betalactamasas como sulbactam y tazobactam (Livermore, 1995). Las primeras, representadas por LEN-1 o SHV-1 en K. pneumoniae o K1 en K. oxytoca, se expresan de forma constitutiva; sin embargo, la betalactamasa cromosómica de P. vulgaris, cefuroximasa, es de carácter inducible y, al igual que AmpC de E. cloacae o P. aeruginosa, pero con menor frecuencia, se pueden seleccionar durante el tratamiento mutantes que hiperproducen la enzima. Betalactamasas de espectro extendido 36 Además de estas betalactamasas cromosómicas existen otras de clase B, metaloenzimas, con un perfil hidrolítico muy amplio, que afectan a penicilinas, cefalosporinas y carbapenemas y no son inhibidas por ácido clavulánico. Reciben el sobrenombre de carbapenemasas (Livermore et al., 1995). Algunas se producen en microorganismos multirresistentes considerados como patógenos de interés creciente: S. maltophilia (enzima L1), Flavobacterium adoratum y B. cepacia. 1.8.2. Betalactamasas plasmídicas Las primeras betalactamasas plasmídicas que se describieron fueron las encontradas en S. aureus poco tiempo después de introducirse la penicilina en la terapéutica clínica. En España, como en la mayoría de los países, más del 90% de los aislados clínicos de S. aureus producen penicilinasas (Livermore, 1995). Por el momento, estas enzimas son el único ejemplo, entre bacterias grampositivas, de betalactamasas plasmídicas inducibles (Bonfiglio y Livermore, 1994). No se han descrito betalactamasas en Streptococcus spp. y sólo se han identificado, fuera de nuestro país, unas pocas cepas de Enterococcus spp. capaces de sintetizar estas enzimas (Murray, 1992). En las bacterias gramnegativas las betalactamasas plasmídicas están ampliamente difundidas, aunque su incidencia depende de la especie. TEM-1 es la enzima más conocida y está presente en más del 40% de los aislamientos de E. coli y de N. gonorrhoeae y en más del 30% de los aislamientos de H. influenzae (Livermore, 1995). Además, en España, cerca del 90% de los aislamientos de M. catarrhalis producen una betalactamasa plasmídica, BRO-1. Ninguna de estas betalactamasas es inducible y su hiperproducción se debe a la presencia de los genes bla en plásmidos multicopia. Con el incremento de la cantidad de enzima se 1. Introducción 37 produce resistencia a los inhibidores de betalactamasas y a las cefalosporinas de primera generación (Livermore, 1995). Otras enzimas plasmídicas ampliamente difundidas son las oxacilinasas. Son enzimas de clase D con un perfil hidrolítico común muy parecido a las TEM, pero a diferencia de éstas hidrolizan fuertemente a cloxacilina y se inhiben pobremente con los inhibidores de betalactamasas (Livermore, 1995). OXA-1 es la más prevalente ya que, según algunos estudios, hasta el 10% de los aislamientos de E. coli pueden producirla (Wiedemann et al., 1989). Su hiperproducción afecta de forma característica a las cefalosporinas de cuarta generación, sin modificar apenas los valores de CMI de las de tercera generación. Otras enzimas como OXA-10 son más prevalentes en P. aeruginosa. Las betalactamasas tipo AmpC mediadas por plásmidos (MIR-1, MOX-1, FOX-1, CMY-1...) son el resultado de la incorporación de genes cromosómicos en plásmidos. Esto ha dado lugar a betalactamasas plasmídicas con un perfil de substrato similar a la enzima de la que proceden, con una excepción, no son inducibles. La salvedad es la enzima ACT-1, la única betalactamasa plasmídica inducible entre bacterias gramnegativas (Bradford et al., 1997). La presión ejercida por el uso de las cefalosporinas de tercera generación ha determinado que algunas enzimas plasmídicas clásicas TEM-1, TEM-2 y SHV-1, modifiquen, por mutación, su centro activo. Con ello se modifica también el perfil de substrato y se produce la hidrólisis de los betalactámicos de amplio espectro, las cefalosporinas de tercera generación, los monobactámicos y, en menor medida, las cefalosporinas de cuarta generación. Sin embargo, conservan la sensibilidad a cefamicinas (cefoxitina), carbapenémicos e inhibidores de betalactamasas. Las enzimas resultantes de este proceso adaptativo, llamadas betalactamasas de espectro extendido (BLEEs) surgieron en Alemania en el año 1983 y en España en 1988. Betalactamasas de espectro extendido 38 1.9. Betalactamasas de espectro extendido (BLEEs) 1.9.1. Introducción e historia La primera betalactamasa que se describió en una bacteria, concretamente en E. coli, lo fue incluso antes de que el primer betalactámico, la penicilina, fuese usado en la práctica médica (Abraham y Chain, 1940). La primera betalactamasa codificada por plásmidos en microorganismos gramnegativos, la enzima TEM-1, fue descrita a principios de la década de los 60 (Datta y Kontomichalon, 1965). Fue encontrada en un aislamiento de E. coli procedente de un hemocultivo de una paciente llamada ?Temoniera? en Grecia, de ahí la designación de la enzima como TEM. El hecho de que esta enzima esté mediada por plásmidos y transposones ha facilitado el paso de la misma a otras especies bacterianas. Así, años después de este primer aislamiento, la betalactamasa TEM-1 puede encontrarse en múltiples especies de la familia de las Enterobacteriaceae, P. aeruginosa, H. influenzae y N. gonorrhoeae. Otra betalactamasa comúnmente encontrada en K. pneumoniae y E. coli es SHV-1 (de ?sulphydryl variable?). La betalactamasa SHV-1 está codificada por el cromosoma en la mayoría de los aislamientos de K. pneumoniae, pero usualmente es de origen plasmídico en E. coli. En los últimos 20 años se han incorporado nuevos antibióticos betalactámicos con la finalidad de ser resistentes a la hidrólisis por las betalactamasas. Sin embargo, con cada nuevo antibiótico que se ha venido usando para los tratamientos de los pacientes, nuevas betalactamasas han aparecido causando resistencia a este grupo de fármacos: ?Tan pronto como un nuevo antibiótico es introducido para el uso clínico, es identificada una betalactamasa con la capacidad de 1. Introducción 39 destruir esta actividad.? (Bush, 1989). Presumiblemente la presión selectiva del uso de nuevos antibióticos en el tratamiento de las infecciones ha seleccionado nuevas variantes de betalactamasas. Una de estas nuevas clases han sido las oxiimino-cefalosporinas, que desde la década de los 80 comenzaron a extender su uso para el tratamiento de las infecciones graves por bacterias gramnegativas. La primera descripción de una betalactamasa plasmídica con un perfil de resistencia a cefalosporinas de tercera generación y sensibles a cefoxitina se realizó en Europa, en Alemania (Knothe et al., 1983). El análisis de estas cepas demostró con posterioridad que la resistencia era debida a la producción de una betalactamasa plasmídica transferible derivada de SHV-1 y que se denominó SHV-2 (Kliebe et al., 1985). El incremento de espectro que generaba este descubrimiento, especialmente frente a las oxiimino-cefalosporinas, hizo que se las denominara betalactamasas de espectro ampliado, por hidrolizar un rango de betalactámicos más amplio que las enzimas plasmídicas TEM-1, TEM-2 y SHV-1. Hoy se las denomina con mayor propiedad betalactamasas de espectro extendido o BLEEs (Philippon et al., 1989). Hay descritas diferentes BLEEs, por todo el mundo, en diferentes especies de Enterobacteriaceae y P. aeruginosa. Las BLEEs están codificadas por plásmidos (Jacoby y Sutton, 1991). La mayor parte de ellas pertenecen a la clase molecular A, y sus características principales son poseer el aminoácido serina en su centro activo, tener un peso molecular de 29 kD y llevar a cabo la hidrólisis preferentemente de penicilinas (Medeiros et al., 1988). Utilizando el esquema propuesto por Bush, Jacoby y Medeiros (Bush et al., 1995) las BLEEs son definidas como betalactamasas capaces de hidrolizar oxiimino-cefalosporinas, son inhibidas por ácido clavulánico y quedan incluídas en el grupo funcional 2be de esta clasificación (tabla 2). Betalactamasas de espectro extendido 40 1.9.2. Tipos de BLEEs Muchas de las betalactamasas de espectro extendido derivan de las enzimas TEM o SHV, aunque no todas. Mutaciones puntuales en el gen que las codifica incrementan el espectro fenotípico. Las BLEEs se encuentran fundamentalmente en E. coli y K. pneumoniae, sin embargo, también se han descrito en otros géneros de Enterobacteriaceae y P. aeruginosa. 1.9.2.1. Betalactamasas tipo TEM La expresión de una betalactamasa tipo TEM-1 es el mecanismo más común de resistencia a los betalactámicos entre las bacterias gramnegativas (Du Bois et al., 1995). Por encima del 90% de la resistencia a ampicilina en E. coli es debida a la producción de una TEM- 1 (Sanders, 1987). Este mecanismo de resistencia ha sido habitualmente descrito entre Enterobacteriaceae, pero no está confinado sólo a este grupo de bacterias. El gen responsable se localiza en un transposón cuya transposición hace que este gen también se haya descrito en otras especies bacterianas como H. influenzae, Vibrio spp. y N. gonorrhoeae. TEM-2, la primera enzima derivada de TEM-1, presenta una única sustitución, la de glutamina en la posición 39 a lisina respecto a la secuencia de TEM-1 (Barthélémy et al., 1985). Esto genera un cambio del punto isoeléctrico (pI) de 5,4 de TEM-1 a 5,6 en TEM-2, pero no se modifica el perfil de substrato. La prevalencia de TEM-2 entre plásmidos en enterobacterias resistentes a betalactámicos no supera el 4%. TEM-3, originalmente descrita en 1988, fue la primera betalactamasa tipo TEM que mostró un fenotipo propio de una BLEE (Sougakoff et al., 1988). 1. Introducción 41 Phe TEM-4 TEM-9 TEM-25 TEM-48 TEM-49 TEM-53 TEM-63 Val TEM-42 LEU 21 GLN 39 ALA 42 LEU 51 Pro TEM-60 GLY 92 GLU 104 HIS 153 ARG 164 MET 182 GLY 218 ALA 237 GLY 238 GLU 240 ARG 244 THR 265 SER 268 Asp TEM-57 TEM-66 Arg TEM-21 TEM-56 Glu TEM-55 Gly TEM-49 Lys TEM-2 TEM-3 TEM-7 TEM-8 TEM-11 TEM-13 TEM-16 TEM-18 TEM-21 TEM-22 TEM-42 TEM-46 TEM-56 TEM-60 TEM-61 TEM-66 TEM-72 Lys TEM-3 TEM-4 TEM-6 TEM-8 TEM-9 TEM-14 TEM-15 TEM-16 TEM-17 TEM-18 TEM-21 Lys TEM-22 TEM-24 TEM-26 TEM-43 TEM-46 TEM-50 TEM-52 TEM-56 TEM-60 TEM-63 TEM-66 Ser TEM-5 TEM-7 TEM-8 TEM-9 TEM-10 TEM-12 TEM-22 TEM-25 TEM-26 TEM-46 TEM-53 TEM-60 TEM-63 His TEM-6 TEM-11 TEM-16 TEM-27 TEM-28 TEM-29 TEM-43 TEM-61 Thr TEM-20 TEM-43 TEM-52 TEM-63 TEM-72 TEM-1 Thr TEM-5 TEM-24 Lys TEM-5 TEM-10 TEM-24 TEM-27 TEM-28 TEM-42 TEM-46 TEM-47 TEM-48 TEM-49 TEM-61 TEM-68 TEM-72 Met TEM-4 TEM-9 TEM-13 TEM-25 TEM-27 TEM-42 TEM-47 TEM-48 TEM-49 TEM-68 Ser TEM-3 TEM-4 TEM-8 TEM-14 TEM-15 TEM-18 TEM-19 TEM-20 TEM-21 TEM-22 TEM-25 TEM-42 TEM-47 TEM-48 TEM-49 TEM-52 Leu TEM-54 Ser TEM-58 Figura 12: Sustituciones de aminoácidos en la secuencia de TEM-1 dando lugar a las diferentes TEM-BLEE (Bradford, 2001) Como se muestra en la figura 12 las sustituciones en los aminoácidos que ocurren en la secuencia de la enzima TEM se producen en un número limitado de posiciones. La combinación de estos cambios de aminoácidos produce la aparición de los fenotipos BLEEs, tales como la capacidad de hidrolizar oxiimino-cefalosporinas como ceftazidima y cefotaxima, o un cambio en el punto isoeléctrico, que va desde 5,2 a 6,5 (tabla 8, ver más adelante). Algunos de estos cambios son especialmente importantes a la hora de generar un fenotipo BLEE. Por ejemplo, la sustitución de glutamato por lisina en la posición 104 de TEM-1 (TEM- 17), arginina por serina en la posición 164 de TEM-1 (TEM-12) o glicina por serina en la posición 238 de TEM-1 (TEM-19). TEM-12 es una enzima que muestra CMIs más elevadas para ceftazidima que para cefotaxima. La misma sustitución pero en la secuencia de TEM-2 da lugar a TEM-7, que tiene las mismas Betalactamasas de espectro extendido 42 propiedades que TEM-12. El incremento de la capacidad para hidrolizar oxiimino-cefalosporinas no es debida a la adquisición de serina en esta posición sino a la pérdida de arginina. La sustitución de la arginina 164 por histidina en TEM-2 da lugar a TEM-11, que tiene las mismas propiedades (Du Bois et al., 1995). Esta sustitución en la posición 164 de arginina por otro aminoácido sólo se da en las enzimas TEM, no aparece en las enzimas SHV. La sustitución en la posición 104 del ácido glutámico a lisina (TEM-17) no tiene efectos sobre la CMI de ceftazidima pero incrementa la CMI de cefotaxima. La presencia de las dos mutaciones descritas en las posiciones 104 y 164 (TEM-26) incrementa la CMI de ceftazidima mucho más que cualquiera de ellas por separado, sin embargo la CMI para cefotaxima en TEM-26 es la misma que en TEM-17. La presión ejercida por el uso de las cefalosporinas hace que se vayan seleccionando nuevas enzimas como consecuencia de segundas, terceras... mutaciones en la secuencia de aminoácidos, para ir creando enzimas cada vez más eficaces en la hidrólisis de las cefalosporinas. Así por ejemplo, la transición de TEM-26 a TEM-9 se produce por una tercera mutación en la posición 265 de treonina a metionina, incrementando la CMI de cefotaxima en una enzima con una CMI de ceftazidima ya de por sí elevada. Pero además pueden existir mutaciones en determinados lugares que no afectan para nada el perfil de substratos de la enzima. Estas son mutaciones en puntos alejados del centro activo. Así la sustitución de ácido glutámico a lisina en la posición 39 o de treonina a metionina en la posición 261 en las enzimas TEM, no afecta la CMI para las oxiimino-cefalosporinas. Aunque las betalactamasas tipo TEM han sido encontradas sobretodo en E. coli y K. pneumoniae, también han sido halladas en otras especies de bacterias gramnegativas con elevada frecuencia. Betalactamasas de espectro extendido tipo TEM han sido descritas en 1. Introducción 43 géneros de la familia Enterobacteriaceae como E. aerogenes (Dumarche et al., 2002), M. morganii (Perilli et al., 2000), P. mirabilis (Bonnet et al., 1999), P. rettgeri (Marchandin et al., 1999) y Salmonella spp. (Morosini et al., 1995). Más aún, BLEEs tipo TEM también han sido descritas en otras bacterias gramnegativas no enterobacterias; así por ejemplo, TEM-42 fue descrita en un aislamiento de P. aeruginosa (Mugnier et al., 1996) y también se ha descrito una betalactamasa TEM- 17 expresada por un plásmido en un hemocultivo de Capnocytophaga ochracea (Rosenan et al., 2000). 1.9.2.2. Betalactamasas tipo SHV La betalactamasa SHV-1 generalmente se encuentra en K. pneumoniae, siendo responsable de más del 20% de la resistencia a ampicilina mediada por plásmidos en esta especie (Tzouvelekis y Bonomo, 1999). Sin embargo, en muchas cepas de K. pneumoniae el gen bla SHV se encuentra integrado en el cromosoma bacteriano (Livermore, 1995). El gen que codifica SHV-1 comparte un 65% de identidad con el de TEM-1 (Huletsky et al., 1990). No está claro por qué TEM-1 es más prevalente que SHV-1, con un 80% de plásmidos que codifican resistencia a betalactámicos en enterobacterias frente a un 5% para SHV- 1 (Du Bois et al., 1995), posiblemente se deba a que el transposón que contiene a TEM-1 es más móvil. Betalactamasas de espectro extendido 44 Phe SHV-7 SHV-14 SHV-18 Ser SHV-7 SHV-14 ILE 8 LEU 35 ARG 43 LEU 122 MET 129 SER 130 ASN 158 LEU 173 ASP 179 ALA 187 ARG 205 GLY 238 GLU 240 Phe SHV-21 Gly SHV-10 Gln SHV-2a SHV-11 SHV-12 SHV-13 SHV-25 Val SHV-25 Lys SHV-22 Phe SHV-19 SHV-20 SHV-1 Thr SHV-26 Leu SHV-53 SHV-4 Ser SHV-2 SHV-2a SHV-3 SHV-4 SHV-5 SHV-7 SHV-10 SHV-12 SHV-20 SHV-21 SHV-22 Ala SHV-13 SHV-18 Lys SHV-4 SHV-5 SHV-7 SHV-10 SHV-12 SHV-18 SHV-22 Ala SHV-6 Asn SHV-8 Gly SHV-24 Figura 13: Sustituciones de aminoácidos en la secuencia de SHV-1 dando lugar a las diferentes SHV-BLEE (Bradford, 2001) Al contrario que las betalactamasas tipo TEM, existen relativamente pocas betalactamasas derivadas de SHV-1 (figura 13 y tabla 6, ver más adelante). La mayor parte de las variantes SHV poseen un fenotipo BLEE que está generado por la sustitución de un aminoácido serina en lugar de glicina en la posición 238 de su secuencia. Esta mutación está asociada con un gran incremento de la CMI de cefotaxima y un incremento moderado en la CMI de ceftazidima respecto a las CMIs de SHV-1 para estos mismos antibióticos. SHV-3 posee una sustitución de arginina a leucina en la posición 205, y eso no incrementa las CMIs de cefotaxima ni ceftazidima. SHV-5 y todas las variantes derivadas de ésta poseen una sustitución de lisina en lugar de glutamato en la posición 240. El residuo de serina en la posición 238 es fundamental para una hidrólisis eficaz de ceftazidima, y el residuo de lisina en la posición 240 para la hidrólisis eficaz de cefotaxima (Huletsky et al., 1993). Cuando la enzima SHV-5 tiene una sustitución adicional del aminoácido arginina por leucina en la posición 205 tiene un fuerte incremento en la CMI de cefotaxima y ceftazidima. 1. Introducción 45 En conclusión, cuando hay un único cambio en la posición 238 de glicina a serina se incrementa mucho la resistencia a cefotaxima y menos a ceftazidima. Un cambio en la posición 205 no altera el perfil de resistencia de una SHV, sin embargo, la misma sustitución en la posición 205 junto con un cambio en la posición 240 incrementa la capacidad de la enzima para hidrolizar cefotaxima y ceftazidima y aumentan considerablemente los niveles de resistencia a estos antibióticos (Du Bois et al., 1995). Hoy día la mayor parte de las enzimas SHV poseen un fenotipo de BLEE. Sin embargo, una variante, SHV-10, tiene un fenotipo de betalactamasa resistente a inhibidores de betalactamasas (IRT). Esta enzima, derivada de SHV-5, contiene una sustitución adicional en la posición 130, glicina en lugar de serina (Primarakis et al., 1997). La mayor parte de BLEEs tipo SHV se han encontrado en aislados de K. pneumoniae (Tzouvelekis y Bonomo, 1999), sin embargo, también se han visto en C. koseri (anteriormente denominado C. diversus) (El Harrif-Heraud et al., 1997), E. coli (Rasheed et al., 1997) y P. aeruginosa (Naas et al., 1999). 1.9.2.3. Betalactamasas resistentes a inhibidores de betalactamasas (inhibitor-resistant betalactamases o IRT) Aunque las IRT no son propiamente dichas BLEEs, también derivan de las enzimas clásicas TEM y SHV. En los primeros años de la década de los 90 se describieron betalactamasas plasmídicas resistentes a la inhibición por ácido clavulánico. El estudio de la secuencia de nucleótidos reveló que estas enzimas eran variantes de las betalactamasas TEM-1 o TEM-2. A estas enzimas, a las que se les llamó IRT (inhibitor- resistant TEM beta-lactamase), actualmente se les asigna un número más de las designadas como TEM. Así existen más de 19 distintas IRT. Betalactamasas de espectro extendido 46 Las IRT se han encontrado preferentemente en aislamientos clínicos de E. coli (Alonso et al., 2002), pero también en aislados de K. pneumoniae (Lemozy et al.,1995), K. oxytoca (Bermudes et al., 1999), o P. mirabilis (Bret et al., 1996), entre otros. Phe TEM-73 TEM-74 LEU 21 GLN 39 MET 69 GLU 104 ILE 127 SER 130 MET 182 GLU 240 ARG 244 THR 265 SER 268 ARG 275 ASN 276 Ser TEM-50 Lys TEM-59 TEM-65 Lys TEM-50 Gly TEM-59 TEM-76 Arg TEM-39 TEM-78 Cys TEM-83 TEM-1 Thr TEM-32 Ser TEM-30 TEM-44 TEM-74 TEM-77 Cys TEM-31 TEM-65 TEM-73 His TEM-51 Gly TEM-79 Asp TEM-35 TEM-36 TEM-37 TEM-39 TEM-50 TEM-78 Met TEM-68 TEM-73 TEM-74 TRP 165 Gly TEM-49 Leu TEM-38 Gln TEM-45 TEM-82 TEM-83 Ile TEM-32 TEM-37 TEM-40 TEM-83 Leu TEM-33 TEM-35 TEM-39 TEM-45 TEM-50 TEM-77 TEM-81 Val TEM-34 TEM-36 TEM-38 TEM-78 TEM-82 Val TEM-81 Figura 14: Sustituciones de aminoácidos en la secuencia de TEM-1 dando lugar a las diferentes IRT-BLEE (Bradford, 2001) Como consecuencia de que las IRT son resistentes a la inhibición por ácido clavulánico y sulbactam, muestran resistencia clínica al uso de las combinaciones de antibióticos betalactámicos con inhibidores de betalactamasas como amoxicilina-ácido clavulánico, ticarcilina-ácido clavulánico y ampicilina-sulbactam, pero pueden presentar cierta capacidad de inhibición por tazobactam y en consecuencia a la combinación piperacilina-tazobactam (Chaibi et al., 1999). En un estudio sobre resistencias a amoxicilina-ácido clavulánico en E. coli en un hospital de Francia (donde por primera vez se detectaron 1. Introducción 47 IRT) encuentran por encima de un 41% de cepas resistentes productoras de IRT (Lefton-Guibout et al., 2000). Como muestra la figura 14, las mutaciones que dan lugar a las enzimas IRT ocurren en puntos muy específicos sobre la estructura del gen de la enzima TEM-1. Cambios en la metionina 69, en la arginina 244, en la arginina 275 y en el aspártico 276 son algunos ejemplos (Henquell et al., 1995). Generalmente, las cepas aisladas poseen un fenotipo de enzima BLEE o de IRT, pero no suelen darse ambos fenotipos a la vez. Se ha descrito, sin embargo, una enzima, TEM-50, que posee una sustitución común, para un fenotipo BLEE y también para IRT (Sirot et al., 1997). Esta enzima es resistente al ácido clavulánico, pero también posee una leve resistencia a las cefalosporinas de amplio espectro, esto puede ser el inicio de un nuevo grupo de betalactamasas que combinen dos fenotipos de resistencia. Además de las variantes TEM también se han descrito variantes derivadas de SHV-1 (Primarakis et al., 1997) y la enzima denominada OHIO-1 (Bonomo et al., 1992). 1.9.2.4. Betalactamasas tipo CTX-M En los últimos años ha ido surgiendo una nueva familia de BLEEs denominada CTX-M, caracterizadas por conferir resistencia de alto nivel a cefuroxima, cefotaxima y cefepime, prácticamente sin incrementar las CMIs de ceftazidima, ya que la actividad hidrolítica frente a este último antibiótico es mínima comparada con la de las otras cefalosporinas. Además de la rápida hidrólisis de cefotaxima, otra característica de estas enzimas es que son inhibidas mejor por tazobactam que por sulbactam o ácido clavulánico (Tzouvelekis et al., 2000). Principalmente estas enzimas se han descrito en cepas de Salmonella enterica serovar Betalactamasas de espectro extendido 48 Typhimurium (Tzouvelekis et al., 1998) y en E. coli, pero también se han descrito en otras especies de Enterobacteriaceae (tabla 3). El residuo serina en la posición 237, que está presente en todas las CTX-M, juega un papel importante en la actividad tipo BLEE de estas betalactamasas. Este grupo incluye las betalactamasas CTX-M1 (Bauernfeind et al., 1990), CTX-M2 (Bauernfeind et al., 1992), pasando por CTX-M9 (Sabaté et al., 2000), CTX-M10 (Oliver et al., 2001), y hasta CTX-M31 (Quinteros et al., 2003), así como las enzimas Toho-1 (Ishii et al., 1995) y Toho-2 (Ling et al., 1998). Estas enzimas no están estrechamente relacionadas con las betalactamasas TEM o SHV, mostrando sólo un 40% de proximidad genética con estas dos (Tzouvelekis et al., 2000). Sin embargo, hay un alto grado de parecido entre la betalactamasa cromosómica de Kluyvera ascorbata (Klu-1 y Klu-2) y las enzimas tipo CTX-M, lo que sugiere un posible origen en esa especie (Humeniuk et al., 2002). Sin embargo, se han expresado una alta variedad de variantes de las enzimas CTX-M, por lo que es muy improbable que estas enzimas tengan un mismo origen filogenético (Bradford, 2001). Cepas en las que se han aislado enzimas tipo CTX-M han aparecido por múltiples partes del mundo, pero sobretodo se han asociado con brotes focales en el este de Europa, Suramérica y Japón. En menos ocasiones se han descrito aislamientos en el oeste de Europa, y generalmente en pacientes inmigrantes procedentes de las zonas donde se han descrito brotes. Sin embargo, aquí cabe destacar la alta incidencia de aislamientos de enterobacterias con estas betalactamasas en España, lo que puede sugerir una zona endémica en el oeste de Europa. En las zonas donde se han descrito brotes epidémicos los laboratorios describen que los aislamientos con CTX-M son los más frecuentes del grupo de BLEEs (Sabaté et al., 2000). 1. Introducción 49 Tabla 3: Características de algunas BLEEs tipo CTX-M (Bradford, 2001) ?-lactamasa pI País donde se describe Microorganismos (primer aislamiento) CTX-M1 8.9 Alemania, Italia E. coli CTX-M2 7.9 Argentina S. enterica CTX-M3 8.4 Polonia C. freundii, E. coli CTX-M4 8.4 Rusia S. enterica CTX-M5 8.8 Lituania S. enterica CTX-M6 8.4 Grecia S. enterica CTX-M7 8.4 Grecia S. enterica CTX-M8 7.6 Brasil P. mirabilis, E. cloacae, E. aerogenes, C. amalonaticus CTX-M9 8.1 España E. coli CTX-M10 8.1 España E. coli Toho-1 7.8 Japón E. coli Toho-2 7.7 Japón E. coli 1.9.2.5. Betalactamasas tipo OXA Son otro creciente grupo de la familia de las BLEEs. Difieren de las betalactamasas tipo TEM o SHV en que pertenecen a la clase molecular D y a la clase funcional 2d (tabla 2). Las betalactamasas clásicas tipo OXA confieren resistencia a ampicilina y cefalotina y se caracterizan por su alta capacidad hidrolitica sobre oxacilina y cloxacilina y son pobremente inhibidas por ácido clavulánico (Bush et al., 1995). Mientras que muchas BLEEs han sido descritas en E. coli, K. pneumoniae y otras Entrobacteriaceae, las BLEEs tipo OXA han sido descritas principalmente en P. aeruginosa (tablas 4 y 7, ver más adelante). Muchas de las OXA con actividad BLEE derivan de OXA-10 Betalactamasas de espectro extendido 50 (Danel et al., 1999); OXA-14 difiere de OXA-10 en un sólo aminoácido, OXA-11 y OXA-16 difieren en dos y OXA-13 y OXA-19 difieren en nueve. Entre las enzimas relacionadas con OXA-10 las secuencias de aminoácidos difieren en uno o dos aminoácidos. En particular, la sustitución de aspártico en lugar de glicina en la posición 157 es necesaria para una resistencia de alto nivel a ceftazidima (Danel et al., 1999); ésta u otras mutaciones son necesarias para dar a las OXAs un perfil fenotípico propio de una BLEE. A diferencia de las OXAs tipo BLEE que confieren resistencia preferentemente sobre ceftazidima, OXA-17 confiere resistencia a cefotaxima y ceftriaxona (Danel et al., 1999). Con respecto a los inhibidores de betalactamasas, la enzima OXA original se caracteriza por su falta de inhibición por ácido clavulánico, sin embargo, se ha descrito inhibición por éste en OXA-18 (Philippon et al., 1997). En 1997 se describió OXA-21 en A. baumannii, el primer aislamiento de este microorganismo con una enzima de este tipo (Vila et al., 1997). Otras OXAs no BLEE han sido descritas: OXA-20 (Naas et al., 1998), OXA-22 (Nordmann et al., 2000), OXA-24 (Bou et al., 2000), OXA-25, OXA-26, OXA-27 (Afazal-Shah et al., 2001) y OXA-30 (Siu et al., 2000). La mayor parte de estas betalactamasas se han aislado en Turquía y Francia, lo cual puede representar, o bien puntos de focalidad de estas enzimas, o bien que el interés mostrado por los científicos en las mismas ha favorecido su descubrimiento. 1. Introducción 51 Tabla 4: Características de algunas BLEEs tipo OXA (Bradford, 2001) ?-lactamasa pI País donde se describe Microorganismos OXA-11 6.4 Turquía P. aeruginosa OXA-13 8.0 Francia P. aeruginosa OXA-14 6.2 Turquía P. aeruginosa OXA-15 8.7 Turquía P. aeruginosa OXA-16 6.2 Turquía P. aeruginosa OXA-17 6.1 Turquía P. aeruginosa OXA-18 5.5 Francia P. aeruginosa OXA-19 7.6 Francia P. aeruginosa OXA-28 7.6 Francia P. aeruginosa 1.9.2.6. Otras BLEEs Existen otras BLEEs que no han podido clasificarse dentro de ninguna de las familias típicas descritas hasta ahora para estas enzimas (tabla 5). La betalactamasa PER-1 fue la primera, descrita en P. aeruginosa, aislada de un paciente en Turquía (Nordmann et al., 1993). Más tarde se aisló en Salmonella typhimurium, en A. baumannii (Vahaboglu et al., 1997) y también se ha descrito en P. mirabilis (Pagani et al., 2002). Esta enzima representa en Turquía el 60% de las resistencias a ceftazidima en A. baumannii. La enzima PER-2, con un 86% de parecido genético con la enzima PER-1, ha sido descrita en S. typhimurium en Argentina (Bauernfeind et al., 1996). Es curioso que PER-1 haya sido descrita casi exclusivamente en Turquía mientras que PER-2 lo haya sido casi exclusivamente en suramérica. La betalactamasa VEB-1 se describió por primera vez en un aislamiento de E. coli en un paciente en Vietnam (Poirel et al., 1999). CME-1 fue descrita en Chryseobacterium meningosepticum (Rossolini et Betalactamasas de espectro extendido 52 al., 1999). TLA-1 fue identificada en E. coli en México (Silva et al., 2000). Todas estas enzimas confieren resistencia a las oxiimino- cefalosporinas, especialmente a ceftazidima, y a aztreonam. Muestran cierta similitud con cefalosporinasas cromosómicas de Bacteroides spp., pudiendo ser éste su origen filogenético (Rossolini et al., 1999). En un aislamiento de S. marcescens en Brasil se detectó una nueva BLEE, denominada BES-1 (Brazil extended-spectrum beta- lactamase), que presenta unas CMIs de aztreonam (512 µg/ml) y de cefotaxima (64 µg/ml) mayores que la de ceftazidima (8 ?µg/ml). Al secuenciar el gen se comprobó que no se parecía a ninguna de las BLEEs conocidas hasta la fecha, presentando sólo un 47-48% de identidad genética con el de las del tipo CTX-M y un 51% de identidad con la betalactamasa cromosómica de la clase A de Y. enterocolitica. Además tiene resistencia a la inhibición por tazobactam, pero no a la inhibición por ácido clavulánico o sulbactam, algo excepcional en betalactamasas (Bonnet et al., 2000). Tabla 5: Características de otras betalactamasas de espectro extendido (Bradford, 2001) ?-lactamasa pI Substrato País donde se describe Microorganismos BES-1 7.5 Cefotaxima, ceftazidima, aztreonam Brasil S. marcescens FEC-1 8.2 Cefotaxima Japón E. coli GES-1 5.8 Ceftazidima Guinea K. pneumoniae CME-1 > 9.0 Ceftazidima C. meningosepticum PER-1 5.4 Ceftazidima Francia P. aeruginosa PER-2 5.4 Ceftazidima Argentina S. enterica SFO-1 7.3 Cefotaxima Japón E. cloacae TLA-1 9.0 Cefotaxima, ceftazidima, aztreonam Méjico E. coli VEB-1 5.3 Ceftazidima, aztreonam Vietnam E. coli Tabla 6: Betalactamasas de espectro extendido tipo SHV (De: http://www.lahey.org/studies/webt.asp). Última revisión 14 de enero de 2004. Secuencia de aminoácidos Betalactamasa 7 8 18 25 35 43 48 54 64 69 75 89 113 119 122 126 129 130 140 141 142 145 146 149 156 158 173 175 179 187 188 192 193 205 206 226 238 240 243 267 278 pI SHV-1 Y I T A L R E G E M V E L V L A M S A T V P A T G N N G D A A K L R Q P G E A T Q 7.6 SHV-2 S 7.6 SHV-2A Q S 7.6 SHV-3 L S 7.0 SHV-4 L S K 7.8 SHV-5 S K 8.2 SHV-6 A 7.6 SHV-7 F S S K 7.6 SHV-8 N 7.6 SHV-9 Del R N V S K 8.2 SHV-10 Del G R N V S K 8.2 SHV-1 Q 7.6 SHV-12 Q S K 8.2 SHV-13 Q A 7.6 SHV-14 F S 7.0 SHV-15 Q K M K S K SHV-16 7.6 SHV-17 SHV-18 F S A K 7.8 SHV-19 F 7.6 SHV-20 F S 7.6 SHV-21 F F S 7.6 SHV-2 K D K 7.6 SHV-23 SHV-24 G SHV-25 A Q V 7.5 SHV-26 T 7.6 SHV-27 D SHV-28 F SHV-29 Q S A SHV-30 SHV-31 SHV-32 V D SHV-3 S Secuencia de aminoácidos Betalactamasa 7 8 18 25 35 43 48 54 64 69 75 89 113 119 122 126 129 130 140 141 142 145 146 149 156 158 173 175 179 187 188 192 193 205 206 226 238 240 243 267 278 pI SHV-34 F S G S SHV-35 Q K G SHV-36 V Q SHV-37 A Q V H SHV-38 V 7.6 SHV-39 S S SHV-40 Q G SHV-41 F SHV-42 S V SHV-43 F S 8.0 SHV-4 SHV-45 D S K 8.2 SHV-46 SHV-47 A I I SHV-48 I 7.6 SHV-49 SHV-50 T H SHV-51 L A SHV-52 SHV-53 SHV-54 A: alanina, C: cisteína, D: ácido aspártico, E: ácido glutámico, F: fenilalanina, G: glicina, H: histidina, I: isoleucina, K: lisina, L: leucina, M: metionina, N: asparagina, P: prolina, Q: glutamina, R: arginina, S: serina, T: treonina, V: valina, W: triptófano, Y: tirosina. Tabla 7: Betalactamasas de espectro extendido tipo OXA (De: http://www.lahey.org/studies/webt.asp). Última revisión 14 de enero de 2004. Secuencia de aminoácidos Betalactamasa 10 20 48 58 67 76 110 127 131 144 149 164 167 169 184 208 240 258 272 pI OXA-10 I G D N T A Y W G Y E S E 6.1 OXA-11 S D 6.4 OXA-14 D 6.2 OXA-16 T D 6.2 OXA-17 S 6.1 OXA-19 T S N S D F G N A 7.5 OXA-28 T S N S G F G N A 8.1 OXA-35 T S N S F G N A 8.0 OXA-2 D L 7.7 OXA-15 G 8.0 OXA-18 5.5 OXA-32 I OXA-45 OXA-1 A A R D OXA-31 V P G L A: alanina, C: cisteína, D: ácido aspártico, E: ácido glutámico, F: fenilalanina, G: glicina, H: histidina, I: isoleucina, K: lisina, L: leucina, M: metionina, N: asparagina, P: prolina, Q: glutamina, R: arginina, S: serina, T: treonina, V: valina, W: triptófano, Y: tirosina. Tabla 8: Betalactamasas de espectro extendido tipo TEM (De: http://www.lahey.org/studies/webt.asp). Última revisión 14 de enero de 2004. Secuencia de aminoácidos Betalactamasa 4 5 6 21 39 42 51 69 80 84 92 104 115 124 127 130 145 153 163 164 165 182 184 196 204 218 237 238 240 244 262 265 268 275 276 280 289 pI TEM-1 S I Q L Q A L M V V G E D S I S P H D R W M A G R G A G E R V T S R N A H 5,4 TEM-2 K 5,6 TEM-3 K K S 6,3 TEM-4 F K S M 5,9 TEM-5 S T K 5, TEM-6 K H 5,9 TEM-7 K S 5,4 TEM-8 K K S S 5,9 TEM-9 F K S M 5, TEM-10 S K 5,6 TEM-1 K H 5,6 TEM-12 S 5,2 TEM-13 K M 5,6 TEM-15 K S 6 TEM-16 K K H 6,3 TEM-17 K 5, TEM-18 K K 6,3 TEM-19 S 5,4 TEM-20 T S 5,4 Secuencia de aminoácidos Betalactamasa 4 5 6 21 39 42 51 69 80 84 92 104 115 124 127 130 145 153 163 164 165 182 184 196 204 218 237 238 240 244 262 265 268 275 276 280 289 pI TEM-21 K K R S 6,4 TEM-2 K K G S 6,3 TEM-24 K K S T K 6,5 TEM-25 F S M 5,3 TEM-26 K S 5,6 TEM-27 H K M 5,9 TEM-28 H K 6,1 TEM-29 H 5,4 TEM-30 S 5,2 TEM-31 C 5,2 TEM-32 I T 5,4 TEM-3 L 5,4 TEM-34 V 5,4 TEM-35 L D 5,2 TEM-36 V D 5,2 TEM-37 I D 5,2 TEM-38 V L 5,2 TEM-39 L R D 5,4 TEM-40 I 5,4 TEM-41 T 5,2 Secuencia de aminoácidos Betalactamasa 4 5 6 21 39 42 51 69 80 84 92 104 115 124 127 130 145 153 163 164 165 182 184 196 204 218 237 238 240 244 262 265 268 275 276 280 289 pI TEM-42 K V S K M 5,8 TEM-43 K H T 6,1 TEM-4 K S 5,4 TEM-45 L Q 5,2 TEM-46 K K S K 6,5 TEM-47 S K M 6 TEM-48 F S K M 6 TEM-49 F S K M G 6 TEM-50 L K S D 5,6 TEM-51 H 5,2 TEM-52 K T S 6 TEM-53 F S TEM-54 L TEM-5 E 5,2 TEM-56 K K R 6,4 TEM-57 D 5,2 TEM-58 S I 5,2 TEM-59 K G 5,6 TEM-60 K P K S 6,4 TEM-61 K H K 6,5 Secuencia de aminoácidos Betalactamasa 4 5 6 21 39 42 51 69 80 84 92 104 115 124 127 130 145 153 163 164 165 182 184 196 204 218 237 238 240 244 262 265 268 275 276 280 289 pI TEM-62 TEM-63 F K S T 5,6 TEM-65 K C 5,4 TEM-6 K D K S 6 TEM-67 I K C 5,2 TEM-68 S K M L 5,7 TEM-69 TEM-70 Q 5,2 TEM-71 S K 6 TEM-72 K T S K 5,9 TEM-73 F C M 5,2 TEM-74 F 5,2 TEM-75 F H M TEM-76 G TEM-7 L S TEM-78 V R D TEM-79 G TEM-80 L V D 5,2 TEM-81 L V TEM-82 V Q Secuencia de aminoácidos Betalactamasa 4 5 6 21 39 42 51 69 80 84 92 104 115 124 127 130 145 153 163 164 165 182 184 196 204 218 237 238 240 244 262 265 268 275 276 280 289 pI TEM-83 I C Q TEM-84 D TEM-85 F S M TEM-86 F S T M TEM-87 K K C T TEM-8 K T D S 5,6 TEM-89 K K G S 6,2 TEM-90 G 5, TEM-91 C T TEM-92 K K T S 6 TEM-93 T S TEM-94 F K T S M TEM-95 A TEM-96 G TEM-97 D P V L TEM-98 D P M L TEM-9 D P S L TEM-100 TEM-101 K S V TEM-102 D P F S M Secuencia de aminoácidos Betalactamasa 4 5 6 21 39 42 51 69 80 84 92 104 115 124 127 130 145 153 163 164 165 182 184 196 204 218 237 238 240 244 262 265 268 275 276 280 289 pI TEM-103 L 5,2 TEM-104 V TEM-105 N TEM-106 K T 6 TEM-107 K H T S 6 TEM-108 D P E S S TEM-109 TEM-110 F M TEM-111 K D M TEM-112 TEM-113 TEM-114 TEM-115 F H TEM-116 I V TEM-117 F TEM-118 H M TEM-119 TEM-120 F S TEM-121 TEM-122 Secuencia de aminoácidos Betalactamasa 4 5 6 21 39 42 51 69 80 84 92 104 115 124 127 130 145 153 163 164 165 182 184 196 204 218 237 238 240 244 262 265 268 275 276 280 289 pI TEM-123 TEM-124 TEM-125 L L S R D 5.2 TEM-126 E T TEM-127 TEM-128 TEM-129 TEM-130 TEM-131 F K S T T TEM-132 TEM-133 A: alanina, C: cisteína, D: ácido aspártico, E: ácido glutámico, F: fenilalanina, G: glicina, H: histidina, I: isoleucina, K: lisina, L: leucina, M: metionina, N: asparagina, P: prolina, Q: glutamina, R: arginina, S: serina, T: treonina, V: valina, W: triptófano, Y: tirosina. 1. Introducción 63 1.9.3. Epidemiología Las enterobacterias productoras de BLEEs se han aislado con mayor frecuencia en muestras procedentes de pacientes hospitalizados, pero también pueden encontrarse en muestras de origen comunitario. Estos aislamientos pueden aparecer de forma esporádica, sin relación epidemiológica, o dar lugar a brotes nosocomiales. La mayoría de estas epidemias afectan a pocos pacientes en un periodo corto de tiempo, pero también es frecuente la descripción de brotes nosocomiales más extensos. La codificación plasmídica de este tipo de resistencia hace que sea fácilmente transferible por conjugación entre diversas especies bacterianas. Así, podemos detectar brotes debidos a la diseminación de un plásmido (diferentes especies de enterobacterias con un plásmido común), o bien a la diseminación de una cepa resistente (epidemia clonal). Además, estos plásmidos pueden llevar asociada resistencia a otros grupos de antimicrobianos (aminoglucósidos, tetraciclinas, trimetoprim-sulfametoxazol...) por lo que nos encontramos con microorganismos multirresistentes. Todo ello determina que las opciones terapéuticas para las infecciones causadas por bacterias que producen BLEEs sean muy limitadas. El tubo digestivo actúa como reservorio de estos microorganismos multirresistentes; además es el nicho ecológico adecuado para que la resistencia se transmita a otras especies bacterianas. En algunos casos de epidemia la colonización fecal de los pacientes ingresados en unidades de riesgo ha llegado a más del 40%. Algunos factores de riesgo asociados a la colonización fecal por K. pneumoniae productor de BLEEs son la gravedad del proceso clínico al ingreso, la cateterización arterial, la nutrición parenteral, el sondaje vesical, la ventilación mecánica o la terapia antibiótica previa. Todos estos factores Betalactamasas de espectro extendido 64 están relacionados con el tiempo de estancia en UCI y la posibilidad de contacto horizontal a través del personal sanitario. El microorganismo en el que más frecuentemente se han descrito brotes nosocomiales de BLEEs es K. pneumoniae. Probablemente está relacionado con el hecho de que esta especie forma parte de la flora normal, sobrevive durante bastante tiempo sobre la piel y los fómites y acepta con cierta facilidad plásmidos conjugativos. Las primeras epidemias de infección hospitalaria por K. pneumoniae productor de BLEEs fueron descritas en Francia a finales de los ochenta (Legrand et al., 1989). Desde entonces se han documentado por todo el mundo, incluída España, numerosos brotes nosocomiales causados por enterobacterias productoras de BLEEs. Durante muchos años, por tanto, el problema predominante con relación a las BLEEs ha sido la observación de brotes epidémicos nosocomiales de infecciones por K. pneumoniae, especialmente en las unidades de cuidados intensivos y en otras áreas hospitalarias (Legrand et al., 1989; Meyers et al., 1993; Peña et al., 2001b). Más recientemente se ha constatado en Estados Unidos que esta circunstancia incluye también a las residencias geriátricas (Wiener et al., 1999) y orfanatos (Weill et al., 2004). Por otra parte, se han observado también infecciones esporádicas por K. pneumoniae intra o extrahospitalarias (Lautenbach et al., 2001a). Es un hecho reconocido la relación existente entre la observación de estos brotes epidémicos y un amplio consumo de antibióticos, especialmente de cefalosporinas de tercera generación. El consumo elevado de estos antibióticos favorecería la aparición de estos clones de K. pneumoniae productores de BLEEs, que se diseminarían con particular facilidad en centros o unidades con factores predisponentes para la transmisión cruzada entre pacientes sometidos a múltiples manipulaciones (Paterson y Yu, 1999). 1. Introducción 65 Los brotes nosocomiales publicados por E. coli y otras enterobacterias han sido, sin embargo, menos frecuentes (Paterson et al., 2001a) aunque se refieren cada vez más infecciones producidas por estos microorganismos que son de carácter endémico o esporádicas, tanto nosocomiales como de aparente adquisición en la comunidad. Así, el problema se ha extendido de forma muy notable a E. coli y en menor medida a otras enterobacterias (Winokur et al., 2001). Los datos de resistencia antibiótica proporcionados por el proyecto SENTRY (Antimicrobial Surveillance Program), procedentes de aislamientos en pacientes hospitalizados desde 1997 hasta 1999 y englobando hospitales de Norteamérica, Latinoamérica, Europa y el sudeste asiático, han puesto de manifiesto la amplia distribución mundial de estas infecciones, aunque con grandes diferencias según las áreas geográficas (Winokur et al., 2001). Como puede observarse en la figura 15 y en la tabla 9, el mayor porcentaje corresponde a América Latina, con el 45% de los aislados de K. pneumoniae productor de BLEEs, seguido de la región del Sudeste asiático y de Europa, con el 25% y el 22% respectivamente, siendo la incidencia mucho menor en Estados Unidos o Canadá, con cifras del 8% y el 5%. Teniendo en cuenta ésto, los autores plantean la posibilidad de que en estas áreas la presión selectiva ejercida por el abuso de cefalosporinas de tercera generación podría ser la explicación. Los datos que este estudio aporta sobre la presencia de BLEEs en Europa son similares a los aportados por el grupo GEIH para España, tal como veremos. En este mismo estudio SENTRY la aplicación de técnicas de tipado molecular en aislados de enterobacterias con BLEEs, confirmó algunos aspectos epidemiológicos importantes. En primer lugar, demostró la diseminación dentro de los hospitales de determinados aislamientos de bacilos gramnegativos productores de BLEEs con idéntico patrón de campo pulsado, situación que corresponde a una Betalactamasas de espectro extendido 66 transmisión clonal. Estas situaciones ya fueron descritas en brotes nosocomiales epidémicos producidos por K. pneumoniae, como ocurrió, por ejemplo, en España (Peña et al., 1998) y como se muestra en la figura 16. También el estudio SENTRY pone de manifiesto la diseminación geográfica entre diferentes especies bacterianas de plásmidos portadores de genes responsables de la codificación de las BLEEs. Una experiencia parecida había sido publicada por el grupo de Wiener demostrando una transmisión similar de plásmidos entre diferentes especies de enterobacterias en pacientes hospitalizados en centros de larga estancia y residencias geriátricas en el área de Chicago con una tasa de infección del 46% de los residentes colonizados con E. coli productor de BLEEs (Wiener et al., 1999). Figura 15: Prevalencia de enterobacterias con fenotipo BLEEs en América, Europa y Asia. Estudio SENTRY. (Winokur et al., 2001) En otros países también se han descrito epidemias como el brote nosocomial de origen clonal en una UCI neonatal del hospital de Cuernavaca, México (Silva et al., 2001); el de un hospital de Río de Janeiro, donde los principales factores de riesgo asociados a esta 0 10 20 30 40 50 % cepas K. pneumoniae E. coli P. mirabilis Salmonella spp. Canadá Eur opa Latinoamérica Es tados Uni dos Sudeste asiático 1. Introducción 67 infección fueron parto prematuro, peso muy bajo al nacer y asfixia (Martins-Loureiro et al., 2001); o el brote en una UCI por K. pneumoniae en un hospital de Amman, Jordania (Shehabi et al., 2000), o en un hospital de Lisboa, Portugal (Barroso et al., 2000), en ambos casos por una enzima TEM-10. Tabla 9: Distribución de los microorganismos productores de BLEEs en las zonas del estudio SENTRY (Winokur et al., 2001) Número (%) de aislamientos con fenotipo BLEE Organismo, país o región (número de aislamientos estudiados) Todos los substratos 1 Ceftazidima 2 Ceftriaxona 2 Aztreonam 2 K. pneumoniae Canadá (n=368) 18 (4.9) 15 (83.3) 9 (50.0) 14 (77.8) Europa (n=946) 214 (22.6) 204 (95.3) 192 (89.7) 199 (93.0) Latinoamérica (n=897) 407 (45.4) 397 (97.5) 385 (94.6) 371 (91.2) Estados Unidos (n=2.017) 153 (7.6) 133 (86.9) 111 (72.5) 113 (73.9) Sudeste asiático (n=560) 138 (24.6) 134 (97.1) 128 (92.8) 129 (93.5) E. coli Canadá (n=1.203) 51 (4.2) 40 (78.4) 20 (39.2) 33 (64.7) Europa (n=3.822) 202 (5.3) 160 (79.2) 125 (61.9) 154 (76.2) Latinoamérica (n=2.026) 173 (8.5) 164 (94.8) 146 (84.4) 157 (90.8) Estados Unidos (n=4.966) 166 (3.3) 117 (70.5) 83 (50.0) 128 (77.1) Sudeste asiático (n=1.104) 87 (7.9) 79 (90.8) 62 (71.3) 80 (92.0) P. mirabilis Canadá (n=97) 3 (3.1) 2 (66.7) 2 (66.7) 1 (33.3) Europa (n=442) 49 (11.1) 42 (85.7) 34 (69.4) 23 (46.9) Latinoamérica (n=196) 44 (22.4) 26 (59.1) 39 (88.6) 28 (63.6) Estados Unidos (n=589) 29 (4.9) 21 (72.4) 12 (41.4) 16 (55.2) Sudeste asiático (n=111) 2 (1.8) 1 (50.0) 1 (50.0) 1 (50.0) Salmonella spp. Canadá (n=11) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Europa (n=128) 1 (0.8) 1 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Latinoamérica (n=125) 3 (2.4) 3 (100.0) 2 (66.7) 2 (66.7) Estados Unidos (n=79) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Sudeste asiático (n=88) 3 (3.4) 3 (100.0) 3 (100.0) 3 (100.0) 1 CMI de ceftazidima, ceftriaxona o aztreonam > 2 µg/ml 2 CMI > 2 µg/ml. Porcentajes calculados sobre el total de aislamientos con fenotipo BLEE detectado por cualquiera de los tres antibióticos Betalactamasas de espectro extendido 68 En España, los primeros microorganismos productores de BLEEs se describieron en 1988, aunque en estudios retrospectivos se identificaron microorganismos con perfiles de sensiblidad compatibles con la producción de BLEEs en bacterias aisladas en Madrid entre 1985 y 1987 (Baquero et al., 1988). La primera epidemia por bacterias poseedoras de BLEEs conocida en nuestro país (1988-1990) incluyó aislamientos de K. pneumoniae (61%), S. marcescens (31%), K. oxytoca (5%) y E. coli (3%). Estos aislados también eran resistentes a aminoglucósidos, cloranfenicol, sulfamidas y tetraciclinas (Fernández- Rodríguez et al., 1992a). De entre los estudios posteriores sobre microorganismos productores de BLEEs en nuestro país, cabe destacar los realizados sobre el brote ocurrido en el hospital de Bellvitge (Barcelona) entre 1993 y 1995, durante el cual los aislados de K. pneumoniae productores de En las líneas 2 y 3, aislamientos de sangre de pacientes no ingresados en UCI. Líneas 4, 5, 6 y 10, aislamientos de sangre de pacientes de UCI En las líneas 7 y 8, 11 y 12, 13 y 14 aislamientos de sangre y heces respectivamente de tres pacientes, (como vemos son idénticas dos a dos) En la línea 9 un aislamiento de sangre con un perfil de sensibilidad distinto al resto de las muestras, esta cepa era la única sensible a gentamicina y ciprofloxacino. Figura 16: Resultados de electroforesis en campo pulsado. Brote nosocomial por K. pneumoniae productor de BLEEs en el hospital de Bellvige (tomado de Peña et al., 1998) 1. Introducción 69 BLEEs supusieron el 35% del total de aislamientos de esta especie. El 72% de los pacientes en los que se aislaron K. pneumoniae productor de BLEEs estaban ingresados en UCI. Entre estos existía un clon predominante que producía, en la mayoría de los casos, una BLEE de punto isoeléctrico 7,6 (Peña et al., 1998). También se realizó en Barcelona (Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) un estudio con aislados clínicos resistentes a cefalosporinas de tercera generación obtenidos entre 1994 y 1996, en el que encontraron solamente expresión de BLEEs en el 0,17% de K. pneumoniae y en el 0,14% de E. coli. Las BLEEs se identificaron como TEM-12, SHV-2 y CTX-M9. En el mismo hospital, en un periodo posterior al de este estudio (1997-1999), los porcentajes de aislamientos productores de BLEEs aumentaron ligeramente (K. pneumoniae 1,6% y E. coli 0,5%) siendo en este periodo más del 70% de las BLEEs observadas del tipo CTX-M9 (Sabaté et al., 2002). En otro estudio del Hospital Ramón y Cajal (Madrid) sobre aislados de K. pneumoniae entre 1989 y 2000, los aislados productores de BLEEs representaron el 4,8% del total de K. pneumoniae. La mayoría de los aislamientos procedían de pacientes ingresados en la UCI y en unidades quirúrgicas. En este estudio se observó una gran variabilidad genética (31 clones en 62 aislados evaluados) y se reconocieron 6 BLEEs diferentes (Coque et al., 2002a). Uno de los clones produjo una epidemia en una UCI neonatal entre 1997 y 1998 (Asensio et al., 2000). Hasta ahora se carece de datos que permitan conocer la frecuencia de enterobacterias productoras de BLEEs en España. Por este motivo, el Grupo de Estudio de Infección Hospitalaria (GEIH) de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC) inició un estudio prospectivo multicéntrico para conocer la prevalencia real de los dos principales patógenos productores de BLEEs, K. pneumoniae y E. coli, en diferentes áreas geográficas de nuestro país Betalactamasas de espectro extendido 70 (Hernández et al., 2003a). En este estudio participaron 40 hospitales nacionales y los resultados quedan resumidos en la tabla 10. A lo largo de los 4 meses de estudio, se enviaron 352 aislados clínicos: 262 E. coli, 81 K. pneumoniae y 9 aislamientos de otras especies. De los 352 aislados se confirmó la producción de BLEEs en 240 (68%). De éstos, 170 (71%) se identificaron como E. coli y 70 (29%) como K. pneumoniae. Estos valores indican que el porcentaje de aislados productores de BLEEs del total de cada especie recibidos fue del 64,9% (170/262) en el caso de E. coli y del 86,4% (70/81) en el de K. pneumoniae. Se aislaron E. coli productores de BLEEs en 33 hospitales de los 40 participantes (82,5%) y K. pneumoniae productores de BLEEs en 17 (42,5%). En conjunto, se aislaron bacterias productoras de BLEEs de una u otra especie en el 90% de los hospitales participantes. E. coli productores de BLEEs supusieron el 0,5% del total de esta especie aislada en todos los centros. En el caso de K. pneumoniae este porcentaje fue de 2,7%, existiendo mayor dispersión geográfica en los centros con mayores tasas de aislamientos de BLEEs que en el caso de E. coli. Cabe destacar que los 4 hospitales con mayor porcentaje de E. coli productor de BLEEs se encuentran en la comunidad autónoma de Andalucía. Destaca el elevado porcentaje detectado en el Hospital Virgen de la Candelaria de Tenerife (16,7%). 1. Introducción 71 Tabla 10: Frecuencia de aislamientos de E. coli y K. pneumoniae productores de BLEEs en hospitales españoles (Hernández et al., 2003a) HOSPITAL CIUDAD Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Txagorritxu Vitoria (Álava) 0 0 Marina Baixa Villajoyosa (Alicante) 0,8 0 Vega Baja Orihuela (Alicante) 0,19 2,17 Severo Ochoa Cangas del Narcea (Asturias) 0 0 General de Asturias Oviedo (Asturias) 0,93 0 Mérida Mérida (Badajoz) 0,43 0 Son Dureta Palma de Mallorca (Baleares) 0 0,8 Bellvitge Barcelona 0,33 4,97 Clínic Barcelona 0,68 1,75 Vall d?Hebron Barcelona 0,26 1?42 General Yagüe Burgos 0,22 0 Puerta del Mar Cádiz 0 7 Marqués de Valdecilla Santander (Cantabria) 0,36 0 La Mancha Centro Alcázar San Juan (Ciudad Real) 0,7 0 Reina Sofía Córdoba 2,02 1,69 Doctor Negrín Gran Canaria 0,16 4,39 Virgen de las Nieves Granada 2,38 0 San Cecilio Granada 0,59 2,53 Ntra Señora de Aránzazu San Sebastián (Guipúzcoa) 0,05 0 General Ciudad de Jaén Jaén 1,23 11,11 Juan Canalejo A Coruña 0,22 2,4 Arquitecto Marcide Ferrol (A Coruña) 0,59 0 Ramón y Cajal Madrid 1,01 1,51 Gregorio Marañón Madrid 0,76 5,66 12 de Octubre Madrid ND ND Alcorcón Alcorcón (Madrid) 0,1 0 Virgen del Camino Pamplona (Navarra) 1,16 0 Navarra Pamplona (Navarra) 0,26 3,57 Santa María Nai Orense ND ND Provincial de Pontevedra Pontevedra 0,09 0 Xeral Cíes Vigo (Pontevedra) 0,34 0 Clínico Salamanca 0 0 Virgen Macarena Sevilla 2,37 0 San Camilo S. Pere de Ribas (Barcelona) 0,17 0 Virgen de la Candelaria Tenerife 1 16,67 Alcañiz Teruel 0,3 0 Parapléjicos Toledo 0 7,32 Basurto Bilbao-Vizcaia 0 0 Lozano Blesa Zaragoza 0,62 0 Miguel Servet Zaragoza 0,33 0 ND: No determinado por no disponer de los datos de aislamientos totales. Betalactamasas de espectro extendido 72 En la mayoría de los estudios previos, los microorganismos productores de BLEEs se han aislado principalmente en el ámbito hospitalario, y, dentro de éste, en UCIs, ya sea en forma de brotes o como casos aislados. Varios estudios sobre la prevalencia de infección por K. pneumoniae productor de BLEEs en hospitales europeos, indican que hasta el 42% de las K. pneumoniae aisladas en UCIs y el 20% de las aisladas fuera de UCIs producen BLEEs, aunque existen notables variaciones en distintos países, y en diferentes centros del mismo país (Bradford, 2001). En Estados Unidos estas cifras disminuirían hasta el 10% dentro de las UCIs y al menos al 5% fuera de éstas. Si en el estudio GEIH nos referimos exclusivamente a los aislamientos de UCI, la frecuencia de aislamientos de K. pneumoniae sobre el total de aislamientos fue de 4,2%, si bien los porcentajes variaron enormemente según los centros: el mayor porcentaje de aislamientos (64,7%) correspondió al hospital Gregorio Marañón de Madrid. En el caso de E. coli, las cifras fueron significativamente menores, con una frecuencia de 1,3% del total de bacterias aisladas en UCI, correspondiendo, el mayor porcentaje, al Hospital Clínico de Zaragoza. Del total de aislados, el 46% de E. coli y el 66% de K. pneumoniae productores de BLEEs se aislaron en varones. El rango de edad de los pacientes en los que se aisló E. coli productor de BLEEs fue de 0 a 93 años y la mediana de 58 años. En el caso de K. pneumoniae, el rango fue de 8 a 83 años y la mediana de un año. Excluyendo los casos en menores de un año la mediana de edad fue de 64 para E. coli y 53 años para K. pneumoniae. El 51% de las muestras en las que se aisló E. coli productor de BLEEs fueron extrahospitalarias, mientras que el 93% de las muestras de K. pneumoniae productor de BLEEs fueron intrahospitalarias. Los servicios de los que provenían las muestras con E. coli productor de BLEEs fueron (figura 17): medicina (39,5%), cirugía (27%), UCI (15%), 1. Introducción 73 pediatría (7,5%) y otros (11%). E. coli se aisló de (figura 18): orinas (66%), heridas (12%), sangre (11%), broncoaspirados (3%), catéteres (1%) y otras muestras (6%). Las muestras con K pneumoniae productor de BLEEs provenían de los siguientes servicios (figura 17): pediatría (35%), UCI (34%), cirugía (12%), medicina (6%) y otros (13%). K. pneumoniae se aisló de (figura 18): orinas (43%), sangre (16%), broncoaspirados (13%), heridas (10%), catéteres (10%) y otras muestras (8%). En el caso de E. coli productor de BLEEs los datos obtenidos en este estudio indican que, en España, este microorganismo se aisla principalmente en muestras de orina (66%), procedente de personas en un amplio rango de edad (0-93 años) y, en el 51% de los casos, en pacientes no hospitalizados. Por el contrario, los datos de este estudio, en el cual el 93% de los aislamientos de K. pneumoniae productor de BLEEs proceden de muestras intrahospitalarias, indican que este microorganismo sigue siendo un problema principalmente nosocomial y que los servicios donde se encuentran principalmente son las UCIs, tanto de adultos como pediátricas. Es de destacar la gran diferencia en las medianas de edad de los pacientes con aislamientos de E. coli y K. pneumoniae productores de BLEEs. El hecho de que la mediana para K. pneumoniae sea de un año se debe al gran número de aislamientos en unidades de neonatología y pediatría y que, durante el estudio, se produjeron brotes nosocomiales en estas unidades en varios de los hospitales participantes en el mismo. Las diferencias en los porcentajes de aislados de E. coli y K. pneumoniae que verdaderamente producían BLEEs se debe posiblemente a que los aislamientos de E. coli pueden tener CMIs elevadas a cefalosporinas de tercera generación por mecanismos diferentes a la producción de BLEEs, fundamentalmente hiperproducción de AmpC, lo que muy raramente ocurre en K. pneumoniae. Betalactamasas de espectro extendido 74 Figura 17: Distribución de aislados productores de BLEEs por servicios (Hernández et al., 2003a) Figura 18: Distribución de aislados productores de BLEEs por muestras clínicas (Hernández et al., 2003a) En números absolutos, E. coli productor de BLEEs fue más frecuente que K. pneumoniae (170 frente a 70 aislados), tanto en 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 MEDICINA CIRUGÍA PEDIATRÍA UCI OTROS E. coli K. pneumoniae 0 10 20 30 40 50 60 70 ORINAS SANGRE HERIDAS A. BRONQUIAL OTRAS E. coli K. pneumoniae 1. Introducción 75 aislamientos intrahospitalarios como extrahospitalarios. Probablemente este hecho se deba al aumento en el número de aislamientos de E. coli productor de BLEEs en muestras de pacientes no hospitalizados, que supusieron más de la mitad (51%). Hasta hace poco, se consideraba que los microorganismos productores de BLEEs causantes de infecciones eran un problema casi exclusivamente nosocomial, que afectaba a pacientes ingresados con enfermedades debilitantes, tratamiento antimicrobiano de amplio espectro y estancia hospitalaria prolongada, especialmente en UCI y cirugía (Coque et al., 2002a). Posiblemente el uso abusivo de los tratamientos con cefalosporinas orales a nivel extrahospitalario ha favorecido su aparición a nivel comunitario. Los datos del trabajo del GEIH indican, durante el periodo estudiado, una prevalencia global en España de E. coli y K. pneumoniae productores de BLEEs del 0,5% y el 2,7%, respectivamente, datos acordes con los de estudios multicéntricos publicados hasta ahora en países de nuestro entorno, como Francia (De Champs et al., 2000) o Italia, (Spanu et al., 2002) como puede observarse en las tablas 11 y 12. Tabla 11: Distribución de aislamientos productores de BLEEs en enterobacterias (De Champs et al., 2000) Número de aislamientos con BLEEs Especies aisladas Total de aislamientos Total (%) TEM-24 TEM-3 Otras BLEEs E. coli 1606 4 (0.2) 3 0 1 (TEM-52) P. mirabilis 215 8 (3.7) 0 5 3 (TEM-21) K. pnemoniae 138 13 (9.4) 1 11 1 (SHV-5) E. aerogenes 86 46 (53.5) 36 7 3 (SHV-4) Salmonella spp. 32 1 (3.1) 0 0 1 (TEM-4) E. cloacae 30 2 (6.7) 0 1 1 (CTX-M-3) C. koseri 30 5 (16.7) 0 5 0 Otras* 369 0 (0.0) 0 0 0 Total 2506 79 (3.2) 40 29 10 * C. freundii, Enterobacter spp., Hafnia alvei, K. oxytoca, Proteus spp., Providencia spp., Y. enterocolitica. Betalactamasas de espectro extendido 76 Tabla 12: Distribución de aislamientos productores de BLEEs en enterobacterias (Spanu et al., 2002) Número de aislamientos con BLEEs Especies aisladas Total de aislamientos Número (%) de BLEEs TEM SHV TEM y SHV no- TEM/no- SHV E. coli 4604 55 (1.2) 11 (20) 28 (52) 9 (17) 6 (11) K. pneumoniae 946 189 (20.0) 32 (17) 104 (55) 34 (18) 18 (10) K. oxytoca 166 25 (15.1) 9 (36) 10 (40) 1 (4) 5 (20) P. mirabilis 805 131 (16.3) 127 (98) 0 (0) 0 (0) 2 (2) P. vulgaris 52 1 (1.9) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (100) P. stuartii 96 27 (28.1) 22 (88) 0 (0) 3 (12) 0 (0) M. morganii 191 9 (4.7) 7 (78) 1 (11) 0 (0) 1 (11) E. aerogenes 151 31 (20.5) 11 (35) 14 (45) 1 (3) 5 (16) E. cloacae 418 12 (2.9) 3 (25) 3 (25) 6 (50) 0 (0) S. marcescens 224 11 (4.9) 7 (64) 4 (36) 0 (0) 0 (0) C. freundii 256 12 (4.7) 1 (11) 7 (78) 1(11) 0 (0) C. koseri 49 6 (12.12) 4 (67) 2 (33) 0 (0) 0 (0) Otras especies 57 0 (0.0) Total 8015 509 (6.3) 234 (47) 173 (35) 55 (11) 38 (8) 1.9.4. Asociación de resistencias con otros antibióticos Además de su codificación plasmídica, las BLEEs forman parte frecuentemente de transposones o integrones, lo cual determina su asociación con otros determinantes genéticos de resistencia transferibles, como los que confieren resistencia a cotrimoxazol, aminoglucósidos, tetraciclinas u otros (Lautenbach et al., 2001a). Algunos autores han insistido en el posible papel de antibióticos distintos de las cefalosporinas en la aparición y diseminación de estos microorganismos. Se ha observado una asociación frecuente entre la presencia de BLEEs y la resistencia a fluorquinolonas en aislados de K. pneumoniae, a pesar de que la codificación de la resistencia se ubica en el caso de las BLEEs en un plásmido y en el de las quinolonas en el cromosoma (Paterson et al., 2000b). Martínez-Martínez ya demostró la transferencia de resistencia a fluorquinolonas a través de plásmidos en 1. Introducción 77 cepas de K. pneumoniae (Martínez-Martínez et al., 1998). Algunos estudios demuestran que hasta un 55% de los aislados productores de BLEEs son resistentes a fluorquinolonas. Es importante identificar cuáles son los factores de riesgo asociados a la resistencia a fluorquinolonas en microorganismos poseedores de BLEEs porque así se podría preservar la utilidad de estos antibióticos en el uso de infecciones producidas por estas enzimas y reducir la dependencia a carbapenemas y limitar la aparición de microorganismos resistentes a estos últimos (Lautenbach et al., 2001b). Según este mismo estudio, la resistencia a fluorquinolonas en E. coli y K. pneumoniae productores de BLEEs es más frecuente entre los aislados de pacientes que han recibido fluorquinolonas en los 30 días previos a la infección y también entre los pacientes que proceden de una residencia de larga estancia. Se desprende también de este estudio que la resistencia a aminoglucósidos está significativamente asociada con la resistencia a quinolonas en microorganismos productores de BLEEs, lo cual puede ser debido a que el uso de aminoglucósidos puede causar alteración de la permeabilidad de membrana y eso puede ayudar a la resistencia a fluorquinolonas. La relación entre la procedencia del paciente de una residencia de larga estancia y la presencia de microorganismos productores de BLEEs con resistencia asociada a quinolonas se puede explicar por la transferencia horizontal de estos microorganismos entre estas personas (Strausbaugh et al., 1996). Los estudios del GEIH en España y el estudio internacional SENTRY ofrecen cifras de resistencia asociada a otros antibióticos en aislamientos productores de BLEEs como muestran las tablas 13 y 14, respectivamente. Betalactamasas de espectro extendido 78 Tabla 13: CMI de los aislados productores de BLEEs para gentamicina, amikacina y ciprofloxacino (Hernández et al., 2003a) Gentamicina Amikacina Ciprofloxacino Especie y tipo de BLEE CMI 50 CMI 90 CMI 50 CMI 90 CMI 50 CMI 90 P. mirabilis TEM >256 >256 4 128 16 >32 P. stuartii TEM 4 64 16 64 >32 >32 K. pneumoniae TEM 1 64 2 32 < 0.125 >32 SHV 2 16 2 32 < 0.125 2 TEM y SHV 2 32 4 32 < 0.125 >32 no-TEM/no-SHV 4 32 1 4 < 0.125 4 E. coli TEM 4 >256 2 8 0.25 >32 SHV 2 16 2 32 < 0.125 16 E. aerogenes TEM 1 16 64 64 >32 >32 SHV 2 64 8 16 2 >32 1. Introducción 79 Tabla 14: Otras resistencias en aislados productores de BLEEs (Winokur et al, 2001) Porcentaje de resistencia en los aislados Organismo, país o región (aislamientos con fenotipo BLEE) Tobramicina Gentamicina Amikacina Tetraciclina TMP-SMZ Ciprofloxacino K. pneumoniae Canadá (n=18) 16.7 16.7 5.6 61.1 5.6 22.2 Europa (n=214) 80.8 65.0 54.2 49.5 6.4 24.3 Latinoamérica (n=407) 83.5 66.3 66.1 52.0 12.1 23.1 Estados Unidos (n=153) 54.2 49.0 11.1 44.4 17.0 34.6 Sudeste asiático (n=138) 72.5 58.7 37.7 55.1 25.4 44.2 E. coli Canadá (n=51) 13.7 15.7 5.9 45.1 5.9 13.7 Europa (n=202) 32.2 25.7 10.9 61.4 8.9 34.2 Latinoamérica (n=173) 68.8 57.8 48.0 70.5 19.7 52.6 Estados Unidos (n=166) 21.7 21.1 7.8 48.8 6.0 19.3 Sudeste asiático (n=87) 69.0 75.9 11.5 77.0 26.4 65.5 P. mirabilis Canadá (n=3) 33.3 77.7 33.3 100.0 0.0 77.7 Europa (n=49) 59.2 61.2 24.5 93.9 8.2 61.2 Latinoamérica (n=44) 84.1 90.9 47.7 97.7 18.2 79.5 Estados Unidos (n=29) 24.1 34.5 3.4 100.0 6.9 34.5 Sudeste asiático (n=2) 50.0 100.0 0.0 100.0 0.0 50.0 Salmonella spp. Canadá (n=0) - - - - - - Europa (n=1) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Latinoamérica (n=3) 66.7 66.7 33.3 33.3 66.7 0.0 Estados Unidos (n=0) - - - - - - Sudeste asiático (n=3) 33.3 33.3 0.0 100.0 66.7 66.7 TMP-SMZ: Trimetoprim-sulfametoxazol. Betalactamasas de espectro extendido 80 1.9.5. Factores clínicos asociados a la presencia de BLEEs Las formas clínicas de las infecciones por enterobacterias productoras de BLEEs varían según el contexto epidemiológico. Las infecciones de carácter endémico y las aparecidas fuera del entorno de las UCIs se localizan preferentemente en el tracto urinario (Lucet et al., 1996; Peña et al., 1998). En el curso del brote epidémico nosocomial por K. pneumoniae en el hospital de Bellvitge pudieron observarse diferencias significativas en la presencia de las muestras clínicas de los pacientes según estuvieran en UCIs o no: en las UCIs predominaron notablemente la bacteriemia originada en el catéter vascular y la infección del tracto respiratorio, mientras que en las plantas de hospitalización fueron prevalentes la ITU y la infección de localización quirúrgica (tabla 15) (Peña et al., 1998). Así en las UCIs, algunos aislados podrían mostrar una particular tendencia a originar bacteriemias en el catéter intravascular (Peña et al., 2001a). Globalmente, un 40-60% de los pacientes afectados en UCIs son únicamente portadores rectales. Entre los pacientes que desarrollan muestras clínicas positivas, más del 60% tienen auténticas infecciones y en la mayoría puede detectarse previamente el estado de portador rectal. La mortalidad cruda de este grupo de pacientes con infección suele ser elevada, superior al 30% (Lucet et al., 1996; Peña et al., 1998). Tabla 15: Procedencia de muestras clínicas positivas para K. pneumoniae productor de BLEEs en el curso de un brote epidémico nosocomial (Peña et al., 1998) Localización de la infección Ingreso en: Bacteriemia Catéter Tracto respiratorio ITU Herida quirúrgica UCIs 40% 36% 26% 23% 18% No UCIs 16% 0% 3% 55% 34% 1. Introducción 81 1.9.6. Tratamiento de las infecciones por bacterias productoras de BLEEs Las BLEEs confieren resistencia a todas las penicilinas, incluyendo las amino, carboxi y ureidopenicilinas, y a todas las cefalosporinas, incluyendo las de tercera y cuarta generación, con la excepción de cefamicinas. Los únicos betalactámicos que mantienen actividad frente a las enterobacterias productoras de estas enzimas son, además de cefamicinas, como cefoxitina, las combinaciones de betalactámicos con inhibidores de betalactamasas y carbapenemas. Las cefamicinas son frecuentemente activas y podrían ser usadas, pero estos antibióticos desarrollan fácilmente resistencia por alteraciones de la permeabilidad, por lo que no se recomiendan. Hay pocos estudios acerca de la posibilidad de uso de las cefamicinas como tratamiento de estas infecciones. En aquellos casos en los que se ha usado cefoxitina, la infección vuelve a aparecer, pero con aislados resistentes a cefoxitina, es decir, se seleccionan mutantes resistentes de permeabilidad (Pangon et al., 1989; Martínez-Martínez et al., 1996). Es una posibilidad cuando no existe ninguna otra alternativa. En cuanto al tratamiento con cefepime, una cefalosporina de cuarta generación, en los casos en los que se ha usado se ha producido fallo terapéutico (Paterson et al., 2001b). Otra opción terapéutica es el uso de combinaciones de penicilinas con inhibidores de betalactamasas: su uso dependerá de las CMIs que presente el microorganismo a tratar, ya que se han descrito casos de resistencia por hiperproducción de BLEEs y por producción conjunta de una BLEE y una betalactamasa tipo TEM-1. El papel de los betalactámicos asociados a inhibidores de las betalactamasas (piperacilina-tazobactam o amoxicilina-ácido clavulánico) ha sido objeto Betalactamasas de espectro extendido 82 de controversia. Un estudio multicéntrico realizado en Italia sugiere que la actividad in vitro de amoxicilina-ácido clavulánico y de piperacilina- tazobactam son comparables y muy superiores a la de amoxicilina- sulbactam frente a E. coli y K. pneumoniae productoras de BLEEs, con un porcentaje muy elevado de los aislados analizados en el rango de la sensiblidad (Spanu et al., 2002). Por el contrario, otro importante estudio de mayor ámbito sugiere que la producción de BLEEs reduce de forma notable la efectividad de estas combinaciones (Johnson et al., 2002). Su eficacia es menor que la de los carbapenémicos si no se utilizan a dosis muy elevadas (Rice et al., 1991). Se ha comprobado su ineficacia clínica en aquellos casos producidos por aislados que muestran resistencia in vitro (Rice et al., 1996a). En un extenso brote epidémico nosocomial producido por un clon de K. pneumoniae, el 55% de los aislamientos fueron resistentes a piperacilina-tazobactam y el 35% a amoxicilina- ácido clavulánico, siendo, por tanto, variable la expresión fenotípica. La prudencia aconseja no utilizar estos antibióticos empíricamente hasta no conocer el resultado del antibiograma y reservar su empleo, en todo caso, para las infecciones no graves con sensibilidad in vitro comprobada. La combinación de una cefalosporina de tercera generación con un inhibidor de betalactamasas se ha utilizado con éxito en algunos casos para el tratamiento de sepsis causadas por K. pneumoniae y E. coli productores de BLEEs. Sin embargo, el uso de cefalosporinas de tercera generación en el tratamiento de infecciones causadas por enterobacterias productoras de BLEEs está desaconsejado aún cuando las CMIs de estos antibióticos se incluyan dentro del intervalo de sensibilidad, ya que se han descrito fracasos terapéuticos. El índice de éstos es más elevado en pacientes con bacteriemia por K. pneumoniae productor de BLEEs tratados con oxiimino-cefalosporinas con CMIs incluídas en el rango de sensibilidad, como muestra la tabla 16 (Paterson et al., 2001b). En este trabajo se recoge la experiencia de 32 pacientes con infecciones graves 1. Introducción 83 producidas por K. pneumoniae productor de BLEEs que habían recibido tratamiento con cefalosporinas de amplio espectro. Todos los pacientes experimentaron un fracaso terapéutico cuando las CMIs de las cefalosporinas estaban en el rango de sensibilidad intermedia, pero, más importante, el 50% de los pacientes para los que las CMIs de las cefalosporinas estaban dentro del rango de sensibilidad, experimentaron también un fracaso terapéutico. Esto genera necesidad de una correcta detección de las BLEEs por parte de los laboratorios de Microbiología Clínica y señala que las cefalosporinas de amplio espectro son un tratamiento inadecuado para las infecciones graves producidas por bacilos gramnegativos productores de BLEEs. Tabla 16: Evolución de infecciones graves por K. pneumoniae productor de BLEEs en pacientes tratados con cefalosporinas (Paterson et al., 2001b) CMI (µg/ml) Fallo clínico Mortalidad 8 6/6 (100%) 2/6 (33%) 4 2/3 (67%) 0/3 (0%) 2 1/3 (33%) 0/3 (0%) < 1 3/11 (27%) 2 /11 (18%) Los carbapenémicos (imipenem, meropenem y ertapenem) son los antibióticos betalactámicos más activos frente a enterobacterias productoras de BLEEs (Johnson et al., 2002). Estos antibióticos son muy resistentes a la hidrólisis por estas betalactamasas. Aún así, el uso de antibióticos carbapenémicos debe ser moderado puesto que se ha descrito aumento de la resistencia a estos antibióticos en otras especies bacterianas como A. baumannii y P. aeruginosa en aquellos hospitales donde se ha usado extensamente para el tratamiento de infecciones, como el hospital de Bellvitge (Corbella et al., 2000). Estos hallazgos nos Betalactamasas de espectro extendido 84 alertan de la necesidad del uso racional de los antibióticos carbapenémicos para prevenir la aparición de nuevos microorganismos multirresistentes. Aunque los carbapenémicos son los antibióticos de elección, hay que decir que el uso abusivo de estos ha producido la aparición de casos de infecciones en pacientes ingresados en unidades de críticos, producidas por aislados de K. pneumoniae productores de BLEEs, y de betalactamasas plasmídicas de clase C, resistentes a los mismos (Ahmad et al., 1999). Además, Martínez-Martínez et al. (1999) ha demostrado, en aislamientos de K. pneumoniae portadores de BLEEs o de enzimas tipo AmpC mediadas por plásmidos, que la ausencia de determinadas porinas contribuye a disminuir la sensibilidad a carbapenemas. En cuanto al uso de antibióticos no betalactámicos para el tratamiento de las infecciones por enterobacterias productoras de BLEEs, es preciso tener en cuenta la frecuente coexistencia de otros determinantes genéticos que confieren resistencia a otros antimicrobianos, como aminoglucósidos o cotrimoxazol. En muchos casos la resistencia se transfiere conjuntamente con el gen responsable de la BLEE en el mismo transposón, integrón o plásmido. Cuando los microorganismos productores de BLEEs son sensibles a fluorquinolonas, éstos son antibióticos útiles en su tratamiento (Karas et al., 1996). Sin embargo, hay estudios que demuestran que hasta un 55% de estos aislados son resistentes a las mismas (Lautenbach et al., 2001b). Los estudios del GEIH en España y el estudio internacional SENTRY también ofrecen resultados de sensibilidad a distintos antibióticos en aislados productores de BLEEs como muestran las tablas 17 y 18, respectivamente. 1. Introducción 85 Tabla 17: Sensibilidad de aislados productores de BLEEs a distintos antimicrobianos (Hernández et al., 2003a) % de sensibilidad BLEE Imipenem Cefoxitina Amoxicilina- clavulánico Piperacilina- tazobactam Ampicilina -sulbactam Gentamicina Amikacina Ciprofloxacino TEM 99.6 79 82 95 69 45 68 32 SHV 100 79 88 88 59 66 86 85 TEM y SHV 100 75 78 84 47 71 69 76 no-TEM/no- SHV 100 76 97 89 39 55 95 71 Tabla 18: Resultados de sensibilidad a distintos antibióticos estudiados para los aislados productores de BLEEs (Winokur et al., 2001) Canadá Europa Latinoamérica Estados Unidos Sudeste asiático Organismo, antibiótico testado CMI50 CMI90 % sens. CMI50 CMI90 % sens. CMI50 CMI90 % sens. CMI50 CMI90 % sens. CMI50 CMI90 % sens. K. pneumoniae Imipenem 0.5 2 100.0 0.25 1 100.0 0. 25 1 99.5 0.25 0.5 99.3 0.25 1 99.3 Cefepime 0.5 4 94.4 4 >16 63.6 16 >16 49.6 1 16 87.6 2 >16 76.7 Ceftzidima 2 >16 72.2 >16 >16 14.5 >16 >16 27.0 >16 >16 39.9 >16 >16 22.5 Aztreonam 4 >16 55.6 >16 >16 16.4 >16 >16 20.9 >16 >16 43.8 >16 >16 18.1 Ceftriaxona 1 >32 72.2 >32 >32 23.8 >32 >32 17.9 8 32 59.5 32 >32 17.4 Cefoxitina 16 >32 38.9 4 16 84.6 8 >32 71.0 8 >32 51.6 16 >32 43.5 Ciprofloxacino 0.25 >2 77.8 0.25 >2 75.7 0.25 >2 76.9 1 >2 65.4 1 >2 55.8 Tobramicina 1 >16 83.3 16 >16 19.2 16 >16 17.9 8 >16 45.8 16 >16 27.5 Gentamicina 1 >16 83.3 16 >16 35.0 16 >16 33.7 4 >16 51.0 16 >16 41.3 Amikacina 2 4 94.4 16 32 70.6 16 >32 60.9 2 16 92.2 8 32 84.1 E. coli Imipenem 0.25 0.5 100.0 0.25 1 100.0 0.25 0.5 99.4 0.25 0.5 100.0 0.25 0.5 100.0 Cefepime 0.25 8 94.1 0.5 >16 83.2 4 >16 59.0 0.25 4 94.6 2 >16 71.3 Ceftzidima 4 >16 80.4 4 >16 63.4 16 >16 46.2 4 >16 70.5 4 >16 59.8 Aztreonam 2 16 86.3 4 >16 59.9 >16 >16 32.9 4 >16 69.9 8 >16 57.5 Ceftriaxona 1 32 82.4 4 >32 66.8 >32 >32 28.9 1 32 78.9 16 >32 42.5 Cefoxitina 16 >32 39.2 16 >32 47.5 8 >32 54.9 16 >32 37.3 32 >32 25.3 Ciprofloxacino 0.03 >2 86.3 0.25 >2 65.8 >2 >2 47.4 0.12 >2 80.7 >2 >2 34.5 Tobramicina 2 8 86.3 2 >16 67.8 >16 >16 31.2 2 16 78.3 8 >16 31.0 Gentamicina 1 >8 84.3 1 >16 74.3 16 >16 42.2 1 >8 78.9 8 >16 24.1 Amikacina 4 8 96.1 4 32 89.1 8 >32 69.9 4 8 95.2 2 32 86.5 P. mirabilis Imipenem 2 4 95.9 2 4 100.0 2 4 96.6 Cefepime 4 >16 65.3 >16 >16 22.7 2 >16 82.8 Ceftzidima 8 >16 55.1 2 16 84.1 8 >16 62.1 Aztreonam 1 >16 79.6 2 >16 68.2 8 >16 58.6 Ceftriaxona 16 >32 42.9 >32 >32 18.2 1 >32 72.4 Cefoxitina 8 >32 53.1 8 16 88.6 4 >32 79.3 Ciprofloxacino 2 >2 38.8 >2 >2 11.4 0.12 >2 75.5 Tobramicina 8 16 40.8 16 >16 15.9 2 16 75.9 Gentamicina 16 >16 38.8 >16 >16 9.1 4 >16 65.5 Amikacina 4 >32 81.6 8 >32 68.2 4 8 96.6 Betalactamasas de espectro extendido 86 1.9.7. Prevención y control Las medidas de prevención y control de las infecciones por microorganismos productores de BLEEs están en consonancia con los factores de riesgo y circunstancias epidemiológicas que favorecen el desarrollo y diseminación de los mismos. En algunas ocasiones las bacterias patógenas multirresistentes se presentan en forma epidémica afectando de forma rápida a los pacientes que ingresan, mientras que en otras se seleccionan después de muchos días de estancia y tras diferentes tratamientos antibióticos. Algunas de estas bacterias están presentes en los pacientes en el momento del ingreso, mientras que otras se adquieren durante la estancia en el servicio. Asimismo, existen bacterias multirresistentes que se presentan en forma de colonización. Los factores que se han asociado con el desarrollo de multirresistencia son numerosos y entre ellos destacan, como ya hemos visto, la utilización previa de antibióticos, la estancia prolongada en UCI, la intubación traqueal, la presencia de catéteres venosos, el sondaje vesical, las reintervenciones quirúrgicas, la edad avanzada, la ventilación mecánica y la proximidad con otros pacientes colonizados o infectados (Meyers et al., 1993). Por otro lado, la inmunosupresión, los pacientes que reciben quimioterapia anticáncer y aquellos pacientes que están ingresados en unidades de cuidados intensivos parecen tener un riesgo particular a la infección por bacterias gramnegativas productoras de BLEEs (Siu et al., 1999). El principal mecanismo de transmisión son las manos del personal sanitario, que facilitan la diseminación durante las múltiples maniobras que se realizan a diario para el tratamiento de estos pacientes. La observación de un agrupamiento de casos o de un brote epidémico requiere la puesta en marcha de un sistema de aislamiento de 1. Introducción 87 los pacientes y de un conjunto de medidas preventivas para evitar la diseminación del microorganismo entre el resto de pacientes ingresados.n Estas medidas son conocidas como aislamiento de contacto (Peña et al., 1998; Paterson y Yu, 1999; Lautenbach et al., 2001a). La eficacia de estas medidas depende de la rapidez con la que se indica el aislamiento que, a su vez, depende de la rápida identificación de las bacterias, así como del adecuado cumplimiento de las medidas instauradas (Álvarez- Lerma et al., 2002). Algunas de estas medidas son: ? Ubicación del paciente: Habitación individual con lavamanos. La puerta puede permanecer abierta. ? Uso de guantes (no estériles) durante la manipulación del paciente o del material contaminado. Lavado de manos higiénico antes de entrar en la habitación, lavado de manos con antisépticos antes de salir de la habitación. ? Necesario el uso de bata para todo personal o visitante que esté en contacto directo con el paciente o con superficies u objetos potencialmente contaminados. Quitarse la bata antes de salir de la habitación. ? Necesario el uso de mascarilla durante los procedimientos que puedan generar salpicaduras o nebulizaciones de sangre, fluídos corporales, secreciones y excreciones. ? El material clínico reutilizable (esfingomanómetros, fonendoscopios, termómetro, etc.) y el material para la higiene del paciente, son de uso exclusivo. Al alta del paciente este material debe limpiarse, desinfectarse y/o esterilizarse. El material de un solo uso debe eliminarse. ? Los residuos sanitarios se gestionarán siguiendo la normativa legal vigente, el Decreto 27/1999, de gestión de residuos sanitarios. Betalactamasas de espectro extendido 88 ? Limitar el traslado del paciente fuera de la habitación a las situaciones estrictamente necesarias. Avisar al servicio receptor sobre el requerimiento de medidas de aislamiento. ? Autorizar el menor número posible de visitantes e informarles sobre las medidas de aislamiento a adoptar. ? El material de limpieza será exclusivo para la habitación en aislamiento. El personal de limpieza seguirá las precauciones de este tipo de aislamiento. La limpieza de la habitación se realizará, como mínimo, dos veces al día. Se limpiarán y desinfectarán todas las superficies con una asociación de aldehídos al 1%. ? Para la desinfección final al alta del paciente se retirarán todos los objetos reutilizables y de un solo uso, se aplicará una asociación de aldehídos al 1% en todas las superficies de la habitación y se cerrará la habitación durante 2 horas posteriores a la limpieza. El otro nivel de intervención tiene que ver con la política de utilización de antimicrobianos. La presión antibiótica selectiva, sobretodo con cefalosporinas, se ha señalado como factor desencadenante de brotes epidémicos producidos por K. pneumoniae productor de BLEEs y del mantenimiento de situaciones de endemia elevada (Peña et al., 1998). Sin embargo, en ambientes en los que se detecta endémicamente la presencia de bacilos gramnegativos productores de BLEEs, el papel selectivo de las cefalosporinas puede tener menor importancia, siendo más relevante la presión selectiva antibiótica global (Asensio et al., 2000) o la que ejercen otros grupos de antibióticos como las quinolonas. En este sentido es muy interesante el artículo publicado por Bermejo sobre un estudio de casos y controles en el hospital de Rosario. Observaron que los factores de riesgo independientemente relacionados con la aparición de infección por K. pneumoniae productor de BLEEs 1. Introducción 89 fueron la adquisición nosocomial y el uso previo de ciprofloxacino cuando se administró en el mismo ingreso en que se obtuvo el aislamiento (Bermejo et al., 2003). Obviamente, habrá que evitar en lo posible la utilización de cefalosporinas en la comunidad y también los picos de consumo en los centros hospitalarios, ya que ello se ha relacionado claramente con la aparición de brotes nosocomiales (Paterson y Yu, 1999). Estas medidas no son necesarias en los casos detectados esporádicamente o de naturaleza policlonal. Así, ante la aparición de varios casos es útil proceder al estudio genotípico de los aislados para determinar su relación epidemiológica y en consecuencia la puesta en marcha de estas medidas (Decré et al., 1998). La necesidad de implantar medidas adicionales al refuerzo de las medidas de barrera ante la detección de un brote epidémico por microorganismos productores de BLEEs ha sido cuestionada, ya que algunos autores han controlado estos brotes aplicando esta única medida (Lucet et al., 1996). No obstante, la mayoría de los brotes nosocomiales han sido controlados incorporando a las medidas de intervención una restricción en el consumo de cefalosporinas (Peña et al., 1998; Rahal et al., 1998). Aunque en estos estudios la aplicación simultánea de las medidas epidemiológicas no permite extraer conclusiones estrictas sobre la aportación de cada una de ellas, existen pocas dudas respecto a la importancia de la restricción del consumo de oxiimino-cefalosporinas (Peña et al., 1998). Ello es especialmente significativo en el caso de brotes extensos, delimitados a unas áreas determinadas como las UCIs, asociados a un consumo previo elevado de tales antibióticos. La eficacia de las medidas de barrera para evitar la diseminación se ve incrementada al disminuir la presión antibiótica selectiva. La detección precoz de casos es un aspecto decisivo para frenar la diseminación de las cepas epidémicas, por lo que se recomienda poner en Betalactamasas de espectro extendido 90 marcha un sistema de vigilancia prospectiva de portadores (frotis rectal, cutáneo y faríngeo), especialmente en UCIs. Un aspecto adicional a tener en cuenta en la lucha epidemiológica frente a estas infecciones es el papel desempeñado por las residencias geriátricas o centros de larga estancia (Wiener et al., 1999). En España no existe ningún dato al respecto, aunque probablemente la situación no sea muy diferente de lo descrito en otros países. La eficacia de todas estas medidas epidemiológicas para controlar estos brotes epidémicos es muy variable y depende del contexto concreto y las características epidemiológicas del brote. En algunos casos tiene que recurrirse a la utilización de una descontaminación intestinal selectiva para disminuir el reservorio de los pacientes y amplificar así la eficacia de las otras medidas (Meyers et al., 1993). Otros autores, sin embargo, sólo han tenido que cambiar la política antibiótica para conseguir controlar estas infecciones, cambiando el uso de ceftazidima por piperacilina-tazobactam (Rice et al., 1996b; Paterson et al., 2000a). Otros autores afirman que la restricción del uso de ceftazidima sólo no es suficiente para controlar repetidas infecciones por microorganismos productores de BLEEs (Rahal et al., 1998). 1.9.8. Métodos fenotípicos de detección de la presencia de BLEEs Hay dos importantes razones para detectar en los laboratorios microorganismos productores de BLEEs, por un lado, la existencia de fracasos terapéuticos cuando se han usado cefalosporinas para el tratamiento de infecciones graves producidas por éstos, incluso cuando el organismo es aparentemente sensible a esas cefalosporinas usadas, y por otro, porque la presencia de los mismos supone un serio problema de 1. Introducción 91 control de infección; y, sin embargo, una rápida intervención es muy eficaz en la desaparición del brote. Las BLEEs representan uno de los mecanismos de resistencia más difíciles de detectar por los laboratorios de Microbiología Clínica. Debido a las diferencias en los perfiles de substrato de las diferentes BLEEs y al efecto inóculo con las pruebas standard de sensibilidad, los aislados productores pueden aparecer como falsamente sensibles a muchas de las cefalosporinas (Paterson y Yu, 1999). Es común encontrar resultados ilógicos o inconsistentes cuando microorganismos productores de BLEEs son estudiados por ensayos de sensibilidad antimicrobiana. Por ejemplo, un aislamiento que produce una enzima TEM o SHV de espectro extendido puede aparecer como resistente o intermedio a ceftazidima pero sensible a cefotaxima y aztreonam; y sin embargo, algunas betalactamasas de espectro extendido pueden aparecer como sensibles a ceftazidima pero resistentes a cefotaxima. El National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) ha establecido unas normas para la detección de enzimas tipo BLEE en E. coli, K. pneumoniae y K. oxytoca, basadas en unos puntos de corte que indican la disminución de sensibilidad a los fármacos habitualmente hidrolizados por estas enzimas, y ha establecido un método de confirmación basado en el hecho de la inhibición de estas enzimas por ácido clavulánico. Las técnicas fenotípicas de detección emplean un inhibidor de betalactamasas, usualmente ácido clavulánico, en combinación con una oxiimino-cefalosporina, como ceftazidima o cefotaxima. En estos métodos el ácido clavulánico inhibe a la BLEE, reduciendo el nivel de resistencia a la cefalosporina. Betalactamasas de espectro extendido 92 1.9.8.1. Métodos de difusión con disco Son procedimientos basados en colocar discos de papel de filtro que contienen una cantidad conocida de antibiótico en la superficie de una placa de medio de cultivo previamente inoculada con el microorganismo problema. Habitualmente los discos tienen 6 mm de diámetro y se pueden colocar tantos como antibióticos se quieran estudiar, respetando siempre un número de discos por placa que permita leer los halos de inhibición sin que interfieran unos con otros. Cuando el disco entra en contacto con el medio de cultivo absorbe agua de éste e inmediatamente el antibiótico comienza a difundir de forma radial, formando un gradiente de concentración en el que ésta es, en cada punto, inversamente proporcional a la distancia hasta el borde del disco. En aquellas zonas donde la concentración alcance un valor suficiente, el microorganismo previamente inoculado no podrá crecer, y tras un periodo de incubación adecuado aparecerá un halo de inhibición de crecimiento alrededor de los discos. El diámetro del halo de inhibición indica el grado de sensibilidad del microorganismo al correspondiente antibiótico. Este método no permite establecer la CMI al menos de forma directa. El NCCLS ha establecido los puntos de corte en milímetros de los halos de inhibición de los antibióticos habitualmente usados en clínica que permiten establecer las categorías clínicas de sensible, intermedio y resistente. Las ventajas del método de difusión con discos son su sencillez, flexibilidad y bajo coste, razones que han asegurado su permanencia durante años en los laboratorios. Si el método se estandariza correctamente su fiabilidad es muy elevada. Por otra parte, los halos de inhibición se pueden medir con menos de 0?5 mm de error y con ± 2 mm de reproductibilidad. 1. Introducción 93 Algunas de las pruebas para detectar BLEEs usan métodos de difusión con disco. Uno de los primeros métodos descritos fue el de la doble difusión con disco descrito por Jarlier et al. (1988) como se aprecia en la figura 19A. Se realiza mediante la difusión en agar utilizando una placa de Mueller-Hinton inoculada con una suspensión bacteriana ajustada al patrón 0.5 de McFarland. Sobre ella se colocan discos con carga estándar (30 µg) de cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona y aztreonam dispuestos a una distancia de 30 mm de un disco central de amoxicilina-ácido clavulánico (20/10 µg) como fuente de ácido clavulánico. Se considera que hay presencia de una BLEE cuando se observa un halo reducido para cada uno de las cefalosporinas o aztreonam (diámetros iguales o inferiores a 27, 22, 25 y 27 mm respectivamente), junto con sinergia o ampliación del halo de inhibición en alguna de las cefalosporinas o de aztreonam en la zona cercana al ácido clavulánico. Figura 19A: Resultado de la doble difusión con disco, según la metodología propuesta por Jarlier et al. (1988), para un aislado productor de BLEEs Este es un método fiable para detectar BLEEs, sin embargo, se ha sugerido que la sensibilidad de la prueba aumenta reduciendo la distancia entre discos a 20 mm (Tzelepi et al., 2000). También se ha sugerido el uso de cefpodoxima en la técnica de doble difusión con disco (Coudron Betalactamasas de espectro extendido 94 et al., 1997; Thomson y Sanders, 1997). Una alternativa puede ser la adición de 4 µg/ml de ácido clavulánico en la placa de Mueller-Hinton para potenciar la zona de inhibición de crecimiento de los discos que contengan las cefalosprinas con respecto a placas que no lleven ácido clavulánico (Ho et al., 1998). Un método similar es el empleo de 20 µg de sulbactam junto con discos de oxiimino-cefalosporinas. Un incremento de 5 mm en la zona de inhibición de la cefalosporina cuando hay sulbactam respecto a cuando no lo hay se considera un resultado positivo. Aunque un alto número de BLEEs son detectadas por este método, un número significativo de aislados no lo son, porque cepas productoras de AmpC también muestran incremento del diámetro de la zona de inhibición con la adición de sulbactam (Jacoby y Han, 1996). El NCCLS (NCCLS, 2003a) recomienda el método de difusión con discos, en placas de Mueller-Hinton inoculadas con aislados al 0.5 de McFarland, de cefpodoxima (10µg), cefpodoxima más ácido clavulánico (10/1µg), ceftazidima (30µg), ceftazidima más ácido clavulánico (30/10µg), cefotaxima (30µg) y cefotaxima más ácido clavulánico (30/10µg). La presencia de BLEEs se sospecha cuando se obtienen halos de inhibición, para los discos de cefpodoxima, ceftazidima o cefotaxima, iguales o inferiores a 17, 22 y 27 mm, respectivamente. La confirmación se realiza mediante la demostración de sinergia: se requieren incrementos de 5 mm o más del halo de inhibición con los discos que contienen la cefalosporina y ácido clavulánico, respecto de la cefalosporina sola (figura 19B). 1. Introducción 95 A B Figura 19B: Comparación de diámetros entre discos que contienen sólo a la cefalosporina (A) y los que contienen cefalosporina más ácido clavulánico (B) en un aislado productor de BLEEs 1.9.8.2. Prueba de Epsilon (E-test) Se basa en el mismo fundamento de la difusión con disco, pero en este caso se utilizan tiras de plástico no poroso de 5 cm de largo y 5 mm de ancho en lugar de discos. La tira contiene un gradiente de concentraciones de un antibiótico, una de las superficies de la tira tiene marcadas las distintas concentraciones del gradiente. Tras aplicar la tira a una placa previamente inoculada e incubar ésta adecuadamente, la intersección de la elipse de crecimiento del microorganismo con la tira permite una determinación directa de la CMI. Infinidad de estudios han demostrado que para la mayoría de los microorganismos de interés clínico los valores de CMI obtenidos con este método son similares (en ±1 dilución) a los que se obtienen con los métodos convencionales de dilución (Baker et al., 1991). Las tiras de E-test diseñadas para la detección de microorganismos productores de BLEEs se encuentran divididas en dos gradientes: una mitad consta de una concentración decreciente de ceftazidima desde 32 µg/ml hasta 0,50 µg/ml; la otra mitad de la tira contiene ceftazidima en concentraciones decrecientes desde 4 µg/ml Betalactamasas de espectro extendido 96 hasta 0,064 µg/ml más 4 µg/ml de ácido clavulánico en concentración fija. Se considera positiva la sinergia con ácido clavulánico cuando se observa una disminución de tres o más diluciones de la CMI de ceftazidima cuando se añade ácido clavulánico. Cuando el aislado sospechoso de producir BLEEs tiene poca acción sobre ceftazidima, y más sobre cefotaxima es más útil el uso de E-test de cefotaxima en concentración decreciente de 16 hasta 0,25 µg/ml y la otra mitad con cefotaxima en concentración decreciente desde 1 hasta 0,016 µg/ml más 4 µg/ml de ácido clavulánico en concentración fija, y considerando positiva la sinergia con ácido clavulánico cuando se observa una disminución de tres o más diluciones de la CMI de cefotaxima cuando se añade ácido clavulánico (figura 19C). Figura 19C: Resultado del E-test de cefotaxima (CT) y cefotaxima más ácido clavulánico (CTL) en un aislado productor de una BLEE tipo CTX-M9 1.9.8.3. Métodos automatizados Actualmente es muy común en los laboratorios de Microbiología Clínica el uso de métodos automatizados comerciales de microdilución 1. Introducción 97 en caldo, integrados en sistemas semiautomáticos de incubación, lectura e interpretación de resultados. En la mayoría de los casos estos sistemas preparan diluciones del antimicrobiano en progresión geométrica en base 2 utilizando un medio de cultivo adecuado, que es inoculado, y tras la correspondiente incubación para permitir el crecimiento del microorganismo, se realiza la lectura, determinando qué concentración causa la inhibición del crecimiento del microorganismo. Los valores de CMI reales de un determinado antimicrobiano se encontrarán en algún valor situado entre la CMI experimentalmente obtenida y la concentración inmediatamente inferior. En comparación con los métodos de difusión, los métodos de dilución son técnicamente más complejos y casi siempre más caros Dos de estos métodos automatizados que son capaces de diferenciar aislados productores de BLEEs son VITEK 2 (bioMérieux, Francia) y WIDER (Francisco Soria Melguizo, S.A., España). 1.9.9. Métodos bioquímicos y moleculares para la caracterización de BLEEs Además de la detección de la presencia de una BLEE en un aislado clínico de una enterobacteria, puede ser importante la caracterización molecular de la misma, identificando el tipo de BLEE del que se trata (TEM, SHV, CTX-M...), e, incluso, ante la presencia de un brote, determinar la relación de clonalidad entre los distintos aislamientos obtenidos. Para ello en los laboratorios de Microbiología se pueden desarrollar varias técnicas de identificación bioquímica y molecular basadas, unas en características propias de la betalactamasa como proteína, otras en la detección de los genes responsables de su codificación plasmídica, y en el estudio de clonalidad. Betalactamasas de espectro extendido 98 Por tanto, estos métodos se aplican una vez confirmada la presencia de la BLEE en el aislado correspondiente y sirven para caracterizar dicha enzima. Los métodos bioquímicos incluyen el isoelectroenfoque, el análisis del perfil de substrato, la cinética enzimática y la determinación de los IC 50 para diferentes inhibidores de betalactamasas. Entre los métodos moleculares destacan las sondas de DNA, las técnicas de amplificación y la secuenciación. 1.9.9.1. Isoelectroenfoque El isoelectroenfoque (IEF) permite conocer el punto isoeléctrico (pI) de la proteína y era de gran utilidad cuando existían pocas BLEEs descritas. En la actualidad se utiliza poco debido a la descripción de diferentes BLEEs que comparten idéntico pI. Sin embargo, es muy útil si se combina con el análisis del fenotipo de sensibilidad ya que puede orientar hacia el tipo de BLEE para un análisis posterior del perfil de substrato o el estudio molecular. En las tablas 3 a 8 se han recogido los valores de pI conocidos para las distintas BLEEs tipo CTX-M, OXA, SHV, TEM y otras. 1.9.9.2. Perfil de substrato Se determina por medio de un espectofotómetro la tasa de hidrólisis (Vmáx) relativa de diferentes substratos betalactámicos, generalmente a una concentración elevada (1 mM), en comparación con un substrato estándar (bencilpenicilina, cefaloridina o nitrocefín). 1. Introducción 99 1.9.9.3. Cinética enzimática Consiste en definir el mecanismo de actuación del enzima mediante el estudio cinético de la constante de afinidad (Km) y la eficiencia relativa de hidrólisis (Vmáx/Km) 1.9.9.4. Determinación de los IC 50 Es la concentración de inhibidor de betalactamasas (ácido clavulánico, sulbactam o tazobactam) que reduce la actividad hidrolítica de la BLEE cuando se compara con un control. 1.9.9.5. Sondas de DNA Permiten realizar cribados en colecciones amplias de aislados, sobretodo si se combina con técnicas de hibridación directa sobre colonia. Tienen el inconveniente de precisar diferentes sondas dependiendo de la sospecha del tipo o grupo de BLEE. Por este motivo la detección es solo presuntiva, puede ser positiva en los casos en los que el aislado presente más de una betalactamasa e incluso en situaciones en las que no exista una BLEE. Ejemplos de ello sería el resultado positivo con una sonda TEM en una cepa de E. coli que presenta una betalactamasa de amplio espectro TEM-1 además de la BLEE o el resultado positivo con una sonda SHV en K. pneumoniae ya que la práctica totalidad producen una SHV-1. Betalactamasas de espectro extendido 100 1.9.9.6. Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Por su fácil realización son las que más éxito han tenido como técnicas de caracterización molecular. Aunque tienen los mismos inconvenientes que las sondas de DNA, a diferencia de éstas, permite la posterior secuenciación del producto de PCR. 1.9.9.7. Electroforesis en campo pulsado La principal utilidad de este procedimiento reside en la posibilidad de realizar un estudio de clonalidad. 2. OBJETIVOS 2. Objetivos 103 La aparición de las betalactamasas de espectro extendido ha sido uno de los principales problemas de resistencia a los antibióticos betalactámicos durante las dos últimas décadas. La codificación plasmídica de este tipo de resistencia otorga a estas enzimas algunas características importantes como la facilidad de transmisión por conjugación entre diversas especies bacterianas o la asociación de resistencia a otros grupos de antibióticos, por lo que nos encontramos con microorganismos multirresistentes. Por tanto, las betalactamasas de espectro extendido constituyen un problema sanitario de gran trascendencia clínica, ya que las opciones terapéuticas para las infecciones causadas por microorganismos productores de estas enzimas son muy limitadas. Para evitar fracasos terapéuticos es necesario que los laboratorios de Microbiología Clínica estén capacitados para detectar estas enzimas. El National Committee for Clinical Laboratory Standards ha establecido las normas para la detección in vitro de estas betalactamasas en Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Klebsiella oxytoca, basadas en unos puntos de corte que indican la disminución de sensibilidad a los fármacos hidrolizados por estas enzimas y una confirmación basada en el hecho de la inhibición del enzima por el ácido clavulánico. Se han evaluado distintos métodos para la detección de betalactamasas de espectro extendido: método de aproximación de discos, prueba de Epsilon y sistemas de interpretación automatizada del antibiograma como VITEK o WIDER, pero no se han comparado entre sí los distintos métodos con los mismos aislados clínicos. Su análisis global podría modificar las conclusiones individuales que hasta la fecha se han publicado con los diferentes sistemas por separado. Además, es posible que la información sobre la presencia de aislados clínicos de Escherichia coli y Klebsiella spp. productores de betalactamasas de espectro extendido en España esté distorsionada Betalactamasas de espectro extendido 104 debido al uso frecuente de sistemas automatizados para su detección, que difieren del método recomendado por el National Committee for Clinical Laboratory Standards. Por tanto, cada vez es más importante conocer la distribución y el tipo de betalactamasas de espectro extendido presentes en nuestro medio, para así poder utilizar el mejor procedimiento diagnóstico. Así mismo es importante determinar la posible diseminación clonal de los aislados productores de estas betalactamasas, fundamentalmente en el medio hospitalario. Por todo lo anteriormente expuesto nos hemos planteado los siguientes objetivos en nuestro trabajo: 1. Detectar en nuestro medio la presencia de microorganismos productores de betalactamasas de espectro extendido en las especies Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Klebsiella oxytoca, mediante el método de difusión con discos aconsejado por el National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2. Determinar las características moleculares que definen estas enzimas en nuestro medio. 3. Conocer la distribución demográfica de estos aislados, tanto a nivel hospitalario como extrahospitalario. 4. Realizar un estudio de clonalidad entre los aislados productores de betalactamasas de espectro extendido procedentes, en un periodo concreto de tiempo, de distintos servicios hospitalarios. 2. Objetivos 105 5. Comparar diferentes procedimientos de detección de betalactamasas de espectro extendido (difusión con disco, prueba de Epsilon, VITEK 2 y WIDER) con el método de referencia recomendado por el National Committee for Clinical Laboratory Standards, con el fin de determinar la capacidad de cada uno de ellos para detectar la presencia de betalactamasas de espectro extendido en aislados clínicos de Escherichia coli. Esto nos podría permitir conocer y localizar el método de laboratorio más útil en el trabajo diario de un hospital. 6. Estudiar, en nuestros aislados clínicos productores de betalactamasas de espectro extendido, la asociación existente entre la presencia de la betalactamasa y las resistencias a otros antibióticos. 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3. Material y métodos 109 3.1. Selección de los aislados clínicos Para la realización de este estudio se recogieron un total de 469 aislados bacterianos, de las especies E. coli, K. pneumoniae y K. oxytoca, en el servicio de Microbiología Clínica del Hospital Universitario ?San Cecilio? de Granada en el periodo comprendido entre Marzo de 2000 a Noviembre de 2002, y que formaron parte del conjunto de muestras que diariamente se procesan en este laboratorio procedentes tanto de servicios hospitalarios como de Centros de Atención Primaria, pertenecientes a la zona hospitalaria sur de Granada, atendidos en este hospital. Este proceso de recogida se realizó en dos momentos y con metodología diferente en cada uno de ellos. Desde Marzo de 2000 a Septiembre de 2002 (primer periodo) obtuvimos un total de 415 aislamientos, y en los meses de Octubre y Noviembre de 2002 (segundo periodo), 54 aislados más. Durante el primer periodo los aislados se obtuvieron de forma aleatoria. Cada día, al azar, se seleccionó una colonia con morfología compatible con enterobacteria, crecida en medio de agar McConkey (bioMérieux) y no identificada previamente. Posteriormente, cada enterobacteria fue identificada mediante pruebas bioquímicas (Murray et al., 2003) usando para ello la galería Api20E (bioMérieux). Se seleccionaron sólo aquellas enterobacterias cuya identificación de especie fue E. coli, K. pneumoniae o K. oxytoca. Cualquier otro resultado de especie fue rechazado. Se obtuvieron así 415 aislados (349 E. coli, 46 K. pneumoniae y 20 K. oxytoca). A todas estas bacterias se les realizó un método fenotípico de difusión con disco para detectar la presencia de BLEEs (método que describiremos más adelante y que denominaremos método A). En función de los resultados obtenidos por el método A, las bacterias se clasificaron en dos grupos, aislados productores de BLEEs Betalactamasas de espectro extendido 110 (65 E. coli, 6 K. pneumoniae y ninguna K. oxytoca) y aislados no productores de BLEEs (284 E. coli, 40 K. pneumoniae y 20 K. oxytoca). Una vez clasificados los aislamientos en estos dos grupos los aislados fueron congelados a ?20º C hasta que se procedió a completar el estudio fenotípico de la presencia de BLEEs mediante otros métodos que describiremos más adelante. En el segundo periodo se realizó una recogida sistemática y prospectiva de todas las enterobacterias identificadas en el laboratorio. Se obtuvieron así 744 enterobacterias (357 E. coli, 132 K. pneumoniae, 43 K. oxytoca y 212 enterobacterias pertenecientes a otras especies) correspondientes a 744 sujetos distintos de los que se recibieron muestras en el laboratorio. En este caso la identificación de especie bacteriana se realizó por los procedimientos habituales del laboratorio (método automatizado WIDER). Tras rechazar aquellas especies que no eran objeto de nuestro estudio, en el resto se determinó la presencia de BLEEs mediante el método A y se clasificaron en dos grupos, productoras de BLEEs (50 E. coli, 2 K. pneumoniae y 2 K. oxytoca) y no productoras de BLEEs (307 E. coli, 130 K. pneumoniae y 41 K. oxytoca). Sólo los aislados que fueron productores de BLEEs se conservaron a ?20º C hasta que se completó el estudio fenotípico con el resto de métodos que describiremos más adelante. Por tanto, según lo anteriormente expuesto, el estudio fenotípico completo se realizó en 399 E. coli, 48 K. pneumoniae y 22 K. oxytoca, obteniéndose 125 aislados productores de BLEEs (115 E. coli, 8 K. pneumoniae y 2 K. oxytoca). En este último grupo se realizó análisis bioquímico y molecular del tipo de BLEE presente y en 10 de los aislados intrahospitalarios obtenidos en los meses de Octubre y Noviembre de 2002 se realizó también estudio de clonalidad. Finalmente, la prevalencia de BLEEs se investigó entre todos los aislados obtenidos en Octubre y Noviembre de 2002. 3. Material y métodos 111 Se utilizaron como cepas control de todos los métodos fenotípicos realizados cada día las cepas de referencia K. pneumoniae ATCC 700603 y E. coli ATCC 25922 (Rasheed et al., 2000). 3.2. Detección fenotípica de la presencia de BLEEs Las técnicas fenotípicas que habitualmente se realizan en los laboratorios de Microbiología Clínica con la finalidad de detectar microorganismos productores de BLEEs, emplean un inhibidor de betalactamasas, usualmente el ácido clavulánico, en combinación con una cefalosporina, como cefpodoxima, ceftazidima, cefotaxima o ceftriaxona o con aztreonam. En estos métodos el ácido clavulánico inhibe a la BLEE, reduciendo el nivel de resistencia a la cefalosporina. El NCCLS ha establecido cuáles deben ser las normas para la detección de betalactamasas de espectro extendido en E. coli, K. pneumoniae y K. oxytoca, basadas en unos puntos de corte que indican la disminución de sensibilidad a los fármacos habitualmente hidrolizados por estas enzimas (cefpodoxima, ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona y aztreonam) y una confirmación basada en la inhibición de las mismas por ácido clavulánico. Como se recoge en las tablas 19 y 20, estas directrices señalan que la producción de BLEEs en estas especies debe sospecharse cuando la CMI de cefpodoxima es ? 8 µg/ml o la CMI de ceftriaxona, ceftazidima, cefotaxima o aztreonam es ? 2 µg/ml (NCCLS, 2003b); o bien cuando los diámetros de los halos de inhibición del crecimiento alrededor de discos de cefpodoxima (10 µg), ceftriaxona (30 µg), ceftazidma (30 µg), cefotaxima (30 µg) o aztreonam (30 µg), sean iguales o inferiores a 17, 25, 22, 27, y 27 mm, respectivamente (NCCLS, 2003a). Betalactamasas de espectro extendido 112 Tabla 19: Puntos de corte de CMI en E. coli, K. pneumoniae y K. oxytoca productores de BLEEs (NCCLS, 2003b) Antibiótico Sospecha de BLEE Aztreonam ? 2 µg/ml Cefotaxima ? 2 ?µg/ml Cefpodoxima ?? 8 µg/ml Ceftazidima ?? 2 µg/ml Ceftriaxona ?? 2 µg/ml Tabla 20: Puntos de corte del halo de inhibición de crecimiento para E. coli, K. pneumoniae y K. oxytoca productores de BLEEs en la difusión con disco (NCCLS, 2003a) Antibiótico Disco Sospecha de BLEE Aztreonam 30 µg ? 27 mm Cefotaxima 30 µg ? 27 mm Cefpodoxima 10 µg ? 17 mm Ceftazidima 30 µg ? 22 mm Ceftriaxona 30 µg ? 25 mm Por otra parte, en los laboratorios de Microbiología Clínica está bastante extendido el uso de sistemas automatizados para realizar la identificación y el estudio de sensibilidad de los diferentes microorganismos aislados. Estos sistemas poseen la capacidad de ofrecer al microbiólogo no sólo un estudio in vitro del microorganismo, sino también, a través de programas expertos, una interpretación de los resultados obtenidos y una modificación, en su caso, del resultado obtenido in vitro consecuencia de mecanismos de resistencia inferidos. Dos de estos métodos automatizados que son capaces de diferenciar aislados productores de BLEEs son VITEK 2 (bioMérieux) y WIDER (Francisco Soria Melguizo, S.A.). 3. Material y métodos 113 3.2.1. Métodos de difusión con disco Se realizaron dos procedimientos de difusión con disco para detectar BLEEs en nuestros aislados clínicos. Por un lado se siguieron las directrices del NCCLS (2003a) siguiendo una metodología previamente descrita (Carter et al., 2000; Steward et al., 2001) y al que hemos denominado método A. Además, en todos los aislados se realizó otro método de difusión con disco basado en las directrices de Jarlier et al. (1988) y las modificaciones propuestas a este método sobre reducción de la distancia entre discos de 30 mm a 20-25 mm para incrementar la posibilidad de observar un efecto sinérgico en caso de que exista hiperproducción del enzima o mutantes de permeabilidad (Tzelepi et al., 2000) y sobre introducción de cefpodoxima en lugar de ceftriaxona, por ser una cefalosporina más lábil a estas enzimas (Coudron et al., 1997). Ambas modificaciones, por tanto, con la finalidad de aumentar la sensibilidad de la prueba. A éste lo denominamos método B. Método A: Se realizó la difusión en placas de agar Mueller-Hinton inoculadas con una suspensión bacteriana ajustada al patrón 0.5 de McFarland. Sobre ellas se colocaron discos de cefpodoxima (CPD) (10 µg) (Oxoid, Reino Unido), cefpodoxima más ácido clavulánico (CD01) (10/1 µg), ceftazidima (CAZ) (30 µg), ceftazidima más ácido clavulánico (CD02) (30/10 µg), cefotaxima (CTX) (30 µg) y cefotaxima más ácido clavulánico (CD03) (30/10 µg) y fueron incubadas al aire durante 24 horas a 37ºC. La presencia de una BLEE se sospechó cuando se obtuvieron halos de inhibición, para los discos de CPD, CAZ o CTX, iguales o inferiores a 17, 22 y 27 mm, respectivamente. La confirmación se realizó mediante la demostración de la sinergia entre la cefalosporina y el ácido clavulánico: se requirieron incrementos ? 5 mm del diámetro del Betalactamasas de espectro extendido 114 halo de inhibición del crecimiento con los discos que contienen la cefalosporina y ácido clavulánico, respecto de los que contienen la cefalosporina sola. Éste fue el método considerado de referencia entre los métodos fenotípicos, por ajustarse, desde el punto de vista metodológico, a las directrices del NCCLS. Los resultados obtenidos por este método nos llevaron a clasificar a los aislados en dos grupos, aislados productores de BLEEs, y aislados no productores de BLEEs, como se ha descrito en el apartado 3.1. Método B: Se realizó la difusión en placas de agar Mueller-Hinton (bioMérieux) inoculadas con una suspensión bacteriana ajustada al patrón 0.5 de McFarland. Sobre ellas se colocaron discos con carga estándar (30 µg) de cefotaxima (CTX) (Oxoid), ceftazidima (CAZ), y aztreonam (ATM) y discos de cefpodoxima (10 µg) (CPD) dispuestos a una distancia de 20 mm de un disco central de amoxicilina-ácido clavulánico (20/10 µg) (AMC) (Becton Dickinson, Estados Unidos) como fuente de ácido clavulánico. Fueron incubadas al aire durante 24 horas a 37ºC. Se consideró presencia de una BLEE cuando se observó un halo reducido para cada uno de los antibióticos estudiados (diámetros iguales o inferiores a 27, 22, 27 y 17 mm, respectivamente), junto con una sinergia o ampliación del halo de inhibición en alguna de las cefalosporinas o del aztreonam en la zona cercana al ácido clavulánico. No se valoró la presencia de sinergia cuando los diámetros de inhibición del crecimiento fueron superiores a los límites señalados. En aislamientos de E. coli o K. pneumoniae con hiperproducción de betalactamasa no inducible AmpC, generalmente de tipo plasmídico, según el grado de hiperproducción de la enzima, los inhibidores de betalactamasas, las cefalosporinas (incluyendo cefoxitina) y aztreonam, pueden ser resistentes. Esta situación puede dar lugar a falsos negativos 3. Material y métodos 115 en la detección de betalactamasas de espectro extendido cuando la betalactamasa AmpC está presente conjuntamente con una BLEE en el mismo aislado. En estos casos es necesario recurrir a las cefalosporinas de cuarta generación como cefepime, menos afectadas por la betalactamasa hiperproducida, para observar la sinergia. La resistencia a las cefalosporinas de tercera o a aztreonam y la ausencia de sinergia, pero con presencia de sinergia entre cefepime y ácido clavulánico, es indicativo en estos casos de la existencia de una BLEE (García- Rodríguez et al., 2000; Thomson et al., 2001). Por otro lado, la existencia en Enterobacteriaceae de alteraciones de la permeabilidad, puede disminuir la capacidad de las cefalosporinas de tercera generación de acceder a la bacteria y el efecto sinérgico con ácido clavulánico, de forma que, si coexisten en el mismo aislado, la producción de BLEEs y mecanismos de impermeabilidad, pueden producirse falsos negativos en la detección de betalactamasas de espectro extendido. Cefoxitina es un buen marcador de déficit de porinas en estos casos, ya que, siendo in vitro sensible a las BLEEs, se mostrará resistente en caso de impermeabilidad de la pared bacteriana. Sin embargo, la resistencia a cefoxitina no sólo puede indicar la existencia de alteraciones de permeabilidad sino que también se mostrará resistente cuando exista una betalactamasa AmpC (Hanson, 2003). Por tanto, para detectar la presencia de BLEEs solas o en combinación con la presencia de betalactamasa AmpC o de mecanismos de impermeabilidad en los aislados, paralelamente a las dos pruebas de difusión anteriores, se realizó un procedimiento de difusión con disco para cada uno de los aislados en agar Mueller-Hinton inoculado con una suspensión ajustada al patrón 0.5 de McFarland y para discos con carga estándar (30 µg) de cefepime (FEP) y cefoxitina (FOX) (Oxoid). Betalactamasas de espectro extendido 116 Se valoró el comportamiento de estos dos antibióticos de la siguiente forma: ? Si en el método A ó B existía un fenotipo compatible con la producción de BLEEs, cefepime mostraba sinergia con ácido clavulánico y cefoxitina era sensible (? 18 mm), se consideró que el aislado sólo era productor de BLEEs. ? Si en el método A ó B el aislado se mostraba resistente y sin sinergia con ácido clavulánico, cefepime no presentaba sinergia con ácido clavulánico y cefoxitina era resistente o sensible, no era un aislado productor de BLEEs. ? Si en el método A ó B existía un fenotipo compatible con la producción de BLEEs, cefepime mostraba sinergia con ácido clavulánico y cefoxitina era resistente (< 18 mm), se consideró que el aislado, además de productor de BLEEs, poseía una alteración de la permeabilidad o una producción de betalactamasa AmpC. ? Si en el método A ó B el aislado se mostraba resistente y sin sinergia con ácido clavulánico, cefepime presentaba sinergia con ácido clavulánico y cefoxitina era resistente (< 18 mm), se consideró que el aislado, además de productor de BLEEs, poseía una alteración de la permeabilidad o una producción de betalactamasa AmpC. 3.2.2. Prueba de Epsilon (E-test) Se siguieron las directrices del fabricante con tiras de papel impregnadas con antibiótico (IZASA S.A, España). Para el estudio del comportamiento de los aislados respecto a ceftazidima se usaron tiras en las que una mitad consta de una concentración decreciente de ceftazidima desde 32 µg/ml hasta 0,5 µg/ml (TZ) y la otra contiene desde 4 µg/ml hasta 0,064 µg/ml de ceftazidima con 4 µg/ml de ácido clavulánico en 3. Material y métodos 117 concentración fija (TZL). En el caso del estudio del comportamiento respecto a cefotaxima se emplearon tiras compuestas en una mitad con una concentración decreciente de cefotaxima desde 16 µg/ml hasta 0,25 µg/ml (CT) y la otra mitad con concentraciones desde 1 µg/ml hasta 0,016 µg/ml, con 4 µg/ml de ácido clavulánico en concentración fija (CTL) (Cormican et al., 1996; Leverstein van-Hall et al., 2002). Se realizó la siembra de los aislados en agar Mueller-Hinton desde el inóculo inicial estandarizado al 0.5 de McFarland. Las tiras de E-test fueron colocadas en las placas e incubadas éstas al aire durante 24 horas a 37ºC. La CMI fue interpretada como el punto de intersección de la elipse de inhibición del crecimiento con el borde de la tira. Se consideró positiva la sinergia con ácido clavulánico y presencia de una BLEE cuando hubo una disminución de la CMI de ceftazidma y/o cefotaxima ? 8 veces en presencia de ácido clavulánico. Se consideró negativa la sinergia con ácido clavulánico y se descartó la presencia de una BLEE cuando la disminución de la CMI de ceftazidima y cefotaxima en presencia de ácido clavulánico fue inferior a 8 veces. En aquellos aislados en los que las CMIs fueron superiores o inferiores a los límites superiores o inferiores, respectivamente, para cada pareja de E-test, no se valoró el resultado y se consideró indeterminado (ND). En aquellos aislados en los que las CMIs de CT, TZ, CTL y TZL fueron superiores a los límites superiores de cada tira, y por tanto, se consideraron aislados resistentes a las cefalosporinas y a la combinación de éstas con ácido clavulánico y de resultado indeterminado (ND) para la detección de BLEEs, no se puede descartar la presencia de las enzimas, pues, por ejemplo, CMIs de CT = 64 µg/ml y CTL = 8 µg/ml, son compatibles con la presencia de BLEEs pero están fuera del rango de detección. Por eso, en estos casos, se realizó un método de E-test de Betalactamasas de espectro extendido 118 cefepime (PM) y cefepime con ácido clavulánico (PML) dirigido a detectar la presencia de estas betalactamasas enmascarada por la posible asociación con una enzima AmpC (esta situación puede dar lugar a un falso negativo en la detección de betalactamasas de espectro extendido cuando la betalactamasa AmpC está también presente). Se emplearon tiras compuestas en una mitad con una concentración decreciente de cefepime desde 16 µg/ml hasta 0,25 µg/ml (PM) y la otra mitad con concentraciones desde 4 µg/ml hasta 0,064 µg/ml, con 4 µg/ml de ácido clavulánico en concentración fija (PML). Se consideró positiva la sinergia con ácido clavulánico y presencia de una BLEE cuando hubo una disminución de la CMI de cefepime ? 8 veces en presencia de ácido clavulánico (Bolmström et al., 2002). 3.2.3. Métodos automatizados 3.2.3.1. Sistema VITEK 2 El VITEK 2 (figura 20) es un sistema automatizado capaz, en poco tiempo, de realizar la identificación y el estudio de sensibilidad de bacterias aerobias y levaduras, a través del análisis de una batería de pruebas bioquímicas y de la cinética de crecimiento bacteriana en presencia de antibióticos, en las tarjetas donde son inoculadas. Su sistema experto (Advanced Expert System o AES) está compuesto por una amplia base de datos que contiene información acerca de unos 2.000 fenotipos, unas 20.000 distribuciones de CMIs para diferentes combinaciones de antibióticos y microorganismos, y prevalencias de mecanismos de resistencia en diferentes especies (Sanders et al., 2000). Así, el sistema experto AES puede realizar una interpretación del fenotipo de resistencia a través de la lectura de las CMIs obtenidas para 3. Material y métodos 119 cada identificación bacteriana. La CMI encontrada para un aislamiento y cada antibiótico ensayado por el VITEK 2 se compara con todos los patrones de la base de datos obteniéndose un resultado que será el fenotipo más ajustado de los comparados. Cuando existen combinaciones inapropiadas entre el fenotipo de resistencia y la especie, o el mecanismo que se infiere supone la aparición de resistencia frente a antibióticos sensibles in vitro, el microbiólogo es alertado por el sistema, que modifica la CMI del antibiótico. En todos los casos el sistema VITEK 2 AES emite un informe indicando la CMI in vitro para cada antibiótico ensayado, la categoría clínica para cada antibiótico obtenida en función de la CMI in vitro (S, I o R), la categoría clínica tras la interpretación basada en el fenotipo detectado y por último infiere el mecanismo de resistencia detectado para cada grupo de antibióticos (Leverstein-van Hall et al., 2002; Livermore et al., 2002). Para el estudio de sensibilidad de nuestros aislados clínicos por el sistema VITEK 2, éstos fueron inoculados en las tarjetas AST-N020 siguiendo las instrucciones del fabricante, con inóculos estandarizados al 0.5 de McFarland para cada aislamiento. La identificación de especie para cada aislado no fue obtenida por el sistema VITEK 2 sino introducida en éste por el investigador una vez conocida por las pruebas bioquímicas realizadas en la galería Api20E. Las tarjetas fueron introducidas en el sistema y los resultados de sensibilidad se obtuvieron tras 24 horas, aceptando en su caso, las recomendaciones del sistema AES para la validación del antibiograma correspondiente. Los antibióticos que fueron ensayados en cada aislamiento, las concentraciones que se estudiaron y los rangos de CMI que ofrece el sistema VITEK 2, se recogen en la tabla 21. Betalactamasas de espectro extendido 120 Tabla 21: Composición de la tarjeta AST-N020 de VITEK 2 para el estudio de sensibilidad de los microorganismos gramnegativos (antibióticos ensayados in vitro) Rango de CMI detectado (en µg/ml) Antibiótico Código Concentraciones (en µg/ml) ? ? Ampicilina AM 4, 8, 32 2 32 Amoxicilina/ác. clavulánico AMC 4/2, 16/8, 32/16 2/1 32/16 Piperacilina PIP 4, 16, 64 4 128 Piperacilina/ tazobactam TZP 4/4, 16/4, 128/4 4/4 128/4 Cefalotina CF 2, 8, 32 2 64 Cefuroxima CXM 2, 8, 32 1 64 Cefoxitina FOX 8, 16, 32 4 64 Cefotaxima CTX 1, 4, 16, 32 1 64 Cefpodoxima CPD 0.5, 1, 4 0.25 8 Ceftazidima CAZ 1, 2, 8, 32 1 64 Cefepime FEP 2, 8, 16, 32 1 64 Meropenem MEM 0.5, 4, 16 0.25 16 Amikacina AN 8, 16, 64 2 64 Gentamicina GM 4, 16, 32 1 16 Tobramicina TM 8, 16, 64 1 16 Ciprofloxacino CIP 0.5, 2, 4 0.25 4 Norfloxacino NOR 1, 8, 32 0.5 16 Ofloxacino OFL 0.5, 1, 4 0.25 8 Nitrofurantoína FT 16, 32, 64 16 512 Trimetoprim/ sulfametoxazol SXT 0.5/9.5, 2/38, 16/304 20 (1/19) 320 (16/304) Para cada aislado y cada antibiótico ensayado se obtuvo un informe con el resultado de CMI in vitro, las modificaciones de la CMI propuestas por el sistema según el fenotipo detectado, la categoría clínica para cada antibiótico y el fenotipo de resistencia de cada aislamiento para los distintos grupos de antibióticos. 3. Material y métodos 121 Figura 20: Sistema VITEK 2. 3.2.3.2. Sistema WIDER El sistema WIDER (figura 21) dispone de una cámara fotográfica que obtiene una imagen de los paneles de microdilución usados para la identificación y el estudio de sensibilidad de bacterias. Después de la digitalización de la imagen, el sistema WIDER genera automáticamente la identificación de la bacteria y su perfil de sensibilidad, que dependen del análisis del crecimiento y de los cambios de color en los pocillos de identificación, y de la interpretación de la presencia de crecimiento a diferentes concentraciones de antibióticos en los pocillos de sensibilidad, respectivamente. Este sistema está básicamente formado por un módulo de lectura y un software de análisis, que, de forma automática, detecta el tipo de panel, asigna la identificación más probable como consecuencia del crecimiento y los cambios de color en los pocillos destinados a la identificación (comparando cada perfil de identificación con los perfiles de su base de datos) y además permite determinar la CMI como la concentración más baja con ausencia de crecimiento tras analizar el crecimiento del microorganismo en los pocillos con diferentes concentraciones de antibiótico. El sistema puede proponer al usuario una Betalactamasas de espectro extendido 122 modificación de las categorías clínicas detectadas in vitro en función del fenotipo inferido tras el análisis de los resultados por el software. El sistema Wider ha sido adaptado para leer los paneles de microdilución de MicroScan (Dade-MicroScan, West Sacramento, Califormia) (Cantón et al., 2000). Los antibióticos que fueron ensayados en cada aislamiento y las concentraciones que se estudiaron, se recogen en la tabla 22. Tabla 22: Composición del panel MIC/ID GRAMNEGATIVOS REV.1 del sistema WIDER Antibiótico Código Concentraciones (en µg/ml) Amoxicilina AMX 4, 8, 16 Amoxicilina-ác. clavulánico A/C 4/2, 8/4, 16/8 Ticarcilina TC 16, 32, 64 Piperacilina-tazobactam P/T 16/4, 32/4, 64/4 Cefalotina CF 8 Cefuroxima CFX 4, 8, 16 Cefoxitina CX 8, 16 Cefotaxima CTX 1, 2, 4, 8 Ceftazidima TAZ 1, 2, 4, 8, 16 Ceftazidima-ác. clavulánico TZ/C 1/4, 8/4 Cefepime CFP 1, 2, 4, 8, 16 Imipenem IMI 1, 2, 4, 8 Meropenem MER 1, 2,4, 8 Amikacina AK 4, 8, 16 Gentamicina GM 2, 4, 8 Tobramicina TO 2, 4, 8 Ciprofloxacino CIP 0.12, 1, 2, 4 Ácido nalidíxico NA 4, 16 Nitrofurantoína FD 64 Trimetoprim-sulfametoxazol T/S 2/38, 4/76 Fosfomicina FOS 8, 16, 32 3. Material y métodos 123 Figura 21: Sistema WIDER. En nuestro estudio los paneles del sistema WIDER fueron inoculados con el sistema de inoculación Prompt, siguiendo las instrucciones del fabricante, y posteriormente fueron incubados durante 24 horas a 37º C. La lectura de los paneles se realizó tras las 24 horas de incubación. La identificación de especie para cada aislado no fue obtenida por el sistema sino introducida en éste por el investigador una vez conocida por las pruebas bioquímicas realizadas en la galería Api20E. El sistema WIDER emitió un informe con la identificación de la especie bacteriana, la CMI obtenida in vitro, la categoría clínica correspondiente a dicha CMI, la categoría clínica modificada, en su caso, y el fenotipo o fenotipos de resistencia inferidos. Según el fabricante, para la detección de BLEEs, en todas las enterobacterias, emplea la información aportada por los pocillos de amoxicilina (AMX) de 4 a 16 µg/ml, amoxicilina más ácido clavulánico (A/C) de 4/2 y 16/8 µg/ml, TAZ de 1 a 16 µg/ml, TZ/C de 8/4 y 1/4 µg/ml, CTX de 1 a 8 µg/ml y CX de 8 y 16 µg/ml. La presencia de BLEEs es sugerida por el fabricante cuando el antibiograma es interpretado como AMX resistente, A/C no resistente, TAZ no sensible y CX sensible siendo, además, no sensible para CTX o la CMI para TZ/C es ? 1/4 µg/ml. Betalactamasas de espectro extendido 124 3.3. Métodos bioquímicos y moleculares para la caracterización de BLEEs 3.3.1. Isoelectroenfoque El uso del isoelectroenfoque para caracterizar betalactamasas fue descrito por primera vez por Matthew et al. (1975). Es una técnica basada en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. Moléculas anfotéricas, como las proteínas, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH. La región del ánodo es alcalina y la del cátodo es ácida. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tengan su punto isoléctrico dentro del rango. A bajo pH (alta concentración de hidrogeniones) los grupos carboxilos de las proteínas tienden a estar sin carga (?COOH) y los grupos básicos conteniendo nitrógeno, fuertemente cargados (?NH 3 + ), dando a la mayoría de la proteína una carga neta positiva. A alto pH los grupos carboxilos están negativamente cargados (?COO - ) y los grupos básicos tienden a estar sin carga (?NH 2 ), dando a la mayoría de la proteína una carga neta negativa. A su pH isoeléctrico una proteína no tiene carga, puesto que las cargas positivas y negativas se compensan, y, además, no se mueve dentro del campo eléctrico. Por lo tanto, las sustancias que se encuentran inicialmente en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migrarán hacia el ánodo, mientras que aquellas que se encuentren en medios con pH más elevados que su pI tendrán carga negativa y migrarán hacia el cátodo. La migración les conducirá a una región donde el pH coincidirá con su pI, tendrán una carga neta nula y se detendrán. El gradiente de pH estable entre los electrodos se consigue usando una mezcla en gel de poliacrilamida de anfolitos de bajo peso molecular 3. Material y métodos 125 cuyos pK cubren un rango preestablecido de pH. Los anfolitos suelen ser ácidos poliamino policarboxílicos alifáticos sintéticos y son comercializados en mezclas que cubren determinados rangos de pH. El gel se preenfoca, es decir, se le aplica corriente antes de añadir la muestra para que los anfolitos se muevan y generen el gradiente estable de pH. Seguimos un procedimiento previamente descrito (Cantón y Oliver, 2000). Para obtener las betalactamasas en los aislados de nuestro estudio éstos fueron sometidos a un primer proceso de sonicación (ruptura de las bacterias por ultrasonidos, que permite no desnaturalizar las proteínas y así obtener las betalactamasas). Para realizar el posterior procedimiento de isoelectroenfoque se usaron como controles de pI conocidos extractos ya sonicados de bacterias productoras de BLEEs proporcionadas por los doctores Rafael Cantón y María Teresa Coque del Servicio de Microbiología del Hospital Ramón y Cajal de Madrid: pI 8.2 (SHV-5), pI 8.1 (CTX-M9), pI 7.6 (SHV-1), pI 6.5 (TEM-24), pI 5.4 (TEM-1). 3.3.1.1. Sonicación Se sembraron las muestras en agar-sangre y se incubaron al aire 24 horas a 37º C. En diferentes tubos Falcon (uno por muestra) se vertieron 20-30 ml de caldo LB (Luria-Bertani) (1% de triptona, 1% de NaCl, 0,5% de extracto de levadura) y se sembraron con 4-5 colonias de la bacteria correspondiente crecida en agar-sangre. Los tubos se incubaron a 37ºC entre 6 y 8 horas para favorecer el crecimiento bacteriano. Pasado el tiempo de incubación, los tubos se centrifugaron a 6000 r.p.m. durante 6 minutos a 4ºC, y se decantó el sobrenadante. En cada tubo se añadieron 10 ml de agua destilada y se agitó con vórtex para resuspender de nuevo el sedimento. Se volvieron a centrifugar los tubos Betalactamasas de espectro extendido 126 en las mismas condiciones, tras lo cual se volvió a decantar el agua destilada del sobrenadante. Se añadió después 1 ml de agua destilada por muestra y se agitó de nuevo con vórtex para resuspender. El contenido que quedó en cada tubo (1 ml) se vertió en un eppendorf y se conservaron a ?20ºC. Posteriormente se realizó la sonicación. Para ello se descongelaron las muestras y se colocaron en un recipiente con hielo con el fin de mantener una temperatura baja durante el proceso, evitando la desnaturalización proteica. Cada muestra se sonicó durante unos 60 segundos con 2 segundos de pulso y 60% de potencia. Cada muestra recibió tantos ciclos como fue necesario hasta que se obtuvo un extracto transparente, tras lo cual se centrifugaron a 15000 r.p.m. durante 10 minutos a 4ºC y el sobrenadante se vertió en un nuevo eppendorf que se congeló a ?20ºC. 3.3.1.2. Isoelectroenfoque Se descongelaron las muestras y los controles de pI conocidos y se colocaron en un baño de hielo. En la platina de la unidad Phast System Separation-Control Unit (Amersham biosciences, Estados Unidos) (figura 22) se colocaron los geles de poliacrilamida (PhastGel IEF 3-9, Amersham biosciences) teniendo en cuenta que en cada gel sólo pudieron colocarse 7-8 muestras, incluyendo los controles de pI conocido. Se realizó un preenfoque de los geles. Mientras se realizó el preenfoque se envolvió con parafilm el Phast Gel Sample Well Stamp (Amersham biosciences) y sobre éste, coincidiendo con cada pocillo, se pusieron 6 µl de muestra o control correspondiente y sobre ellas se colocó el Phast Gel Sample Applicator (Amersham biosciences) que absorbió la muestra por capilaridad, y se colocó en la posición inferior de la platina (zona del 3. Material y métodos 127 cátodo). Tras realizar el preenfoque, automáticamente comenzó el proceso por el que las proteínas migran hasta su punto isoeléctrico. Cuando finalizó el proceso se retiraron los peines y los geles. Sobre cada gel se añadieron 100 µl de Nitrocefin (Becton Dickinson) y se extendió. Se pudieron leer los resultados en forma de banda de color rojo (viraje de color amarillo-naranja a rojo intenso consecuencia de la hidrólisis de esta cefalosporina cromogénica por la betalactamasa) que corresponde a un determinado pI, que se pudo determinar en función de los pI conocidos de los controles (figura 25, ver más adelante). Figura 22: Phast System Separation-Control Unit 3.3.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) (Mullis et al., 1986) es una técnica que permite la amplificación de un fragmento de ADN específico mediante síntesis enzimática in vitro a partir de mínimas cantidades de material de partida. La técnica copia la doble cadena de ADN consiguiendo, por repetición del proceso, una amplificación exponencial del material genético. Usa dos oligonucleótidos sintéticos (complementarios a los extremos de la secuencia diana y en sentido antiparalelo uno respecto a otro) como Betalactamasas de espectro extendido 128 cebadores o iniciadores (primers) de una reacción de replicación catalizada por una DNA polimerasa termoestable. La amplificación es el resultado de la repetición de una serie de ciclos compuestos de tres fases: desnaturalización (ruptura, mediante la aplicación de temperatura elevada seguida de un enfriamiento rápido, de los puentes de hidrógeno que mantienen la doble cadena de ADN dando lugar a dos cadenas sencillas sobre las cuales pueda actuar la DNA polimerasa), hibridación (se hace descender la temperatura para que los primers puedan unirse específicamente a las secuencias complementarias en el ADN diana) y elongación (la Taq-DNA polimerasa utiliza los dNTP presentes en el medio para sintetizar la cadena complementaria a partir del cebador hibridado con su secuencia diana en sentido 5? a 3?). Antes de comenzar los ciclos se programa una fase de desnaturalización inicial larga con el fin de asegurar que todo el ADN (fragmento diana y primers) quede en forma monocatenaria, y después del último ciclo de PCR se suele realizar una elongación final prolongada con el fin de terminar todas las elongaciones parciales en curso. Las nuevas cadenas de ADN, producidas en cada ciclo, sirven de molde en el ciclo siguiente, por lo que la repetición de un ciclo de PCR produce una amplificación exponencial del material de partida igual a 2 n , siendo ?n? el número de ciclos realizados. Una vez finalizada la PCR la detección del producto amplificado se realiza mediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN se separan según su tamaño. El gel se tiñe con bromuro de etidio, que se une al ADN de cadena doble de forma inespecífica y se visualiza con luz ultravioleta. En aquellos aislados que confirmaron la presencia de BLEEs por los procedimientos fenotípicos (método A) se realizó PCR para determinar la presencia de los genes bla SHV , bla CTX-M9 , bla CTX-M10 o 3. Material y métodos 129 bla TEM y se realizó aquel procedimiento de PCR que podría confirmar la presencia de la BLEE detectada por isoelectroenfoque. Teniendo en cuenta los datos expuestos en las tablas 3, 6 y 8, las BLEEs tipo SHV poseen puntos isoeléctricos 7,0; 7,5; 7,6; 7,8; 8,0; 8,2; las BLEEs tipo CTX-M poseen puntos isoeléctricos 7,6; 7,7; 7,8; 7,9; 8,1; 8,4; 8,8; 8,9 y las BLEEs tipo TEM poseen puntos isoeléctricos 5,2; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9; 6,0; 6,1; 6,3; 6,5 Como controles positivos se usaron bacterias productoras de BLEEs (CTX-M9, CTX-M10, SHV-5 y TEM-24) proporcionadas por los doctores Rafael Cantón y María Teresa Coque del Servicio de Microbiología del Hospital Ramón y Cajal de Madrid. Como control negativo se usó la cepa E. coli ATCC 25922. 3.3.2.1. Extracción del ADN bacteriano Las muestras y controles se sembraron en agar-sangre e incubaron al aire 24 horas a 37º C. Se puso 1 ml de agua destilada en cada eppendorf (uno por muestra), y en cada uno de ellos se resuspendieron varias colonias de la muestra o controles correspondientes. Los eppendorf se pusieron 15 minutos en un baño a 100º C y posteriormente se centrifugaron 15 minutos a 15000 r.p.m. 3.3.2.2. Amplificación del ADN bacteriano Se utilizó una mezcla de PCR con buffer (1x), MgCl 2 (2 mM), dNTPs (200 µM), primers (0,5 µM) y Taq polimerasa (2 U) (Roche, Alemania) en un volumen final de 15 µl. Los primers usados para cada determinación (Tib Molbiol, Alemania) se muestran en la tabla 23. Betalactamasas de espectro extendido 130 Tabla 23: Primers usados para la detección por PCR de los genes responsables de la producción de BLEEs en nuestras muestras. Gen Primers SHV-3FT 5?-GGGTTATTCTTATTTGTCGC-3? bla SHV (Coque et al., 2002a) SHV-5FT 5?-TTAGCGTTGCCAGTGCTC-3? CTX-F 5?-GTGACAAAGAGAGTGCAACGG-3? bla CTX-M9 (Cantón et al., 2002) CTX-R 5?-ATGATTCTCGCCGCTGAAGCC3? CTX-M-F8 5?-CCGCGCTACACTTTGTGGC-3? bla CTX-M10 (Cantón et al., 2002) CTX-M-R3 5?-TTACAAACCGTTGGTGACG-3? BLA-1 5?-ATGAGTATTCAACATTTCCG-3? bla TEM (Rasheed et al., 1997) BLA 2 5?-CTGACAGTTACCAATGCTTA-3? Las condiciones empleadas en el termociclador (Eppendorf Mastercycler personal) aparecen en la tabla 24: Tabla 24: Condiciones de temperatura para cada una de las PCR realizadas PCR bla SHV PCR bla CTX-M9 PCR bla CTX-M10 PCR bla TEM 94ºC 12 min. 94ºC 12 min. 94ºC 12 min. 94ºC 12 min. *94ºC 1 min. 56ºC 1 min. 72ºC 1 min. *94ºC 1 min. 62ºC 1 min. 72ºC 1 min. *94ºC 1 min. 59ºC 1 min. 72ºC 2 min. *94ºC 30 seg. 55ºC 1 min. 72ºC 1 min. 30 seg. 72ºC 10 min. 72ºC 10 min. 72ºC 10 min. 72ºC 10 min. min.: minutos, seg.:segundos. * 35 ciclos 3.3.2.3. Electroforesis en gel de agarosa Se realizaron geles de agarosa al 0,7% en un tampón de Tris- Borato-EDTA 0,5x (Tris 0,1 M; ácido bórico 0,08 M; EDTA 0,1 mM) con bromuro de etidio y en ellos se depositaron las muestras, tras lo cual el gel se sometió a electroforesis a 90 V durante 30 minutos y se visualizó mediante luz ultravioleta. 3. Material y métodos 131 3.3.3. Electroforesis en gel por campo pulsado La electroforesis en gel por campo pulsado (PFGE, pulsed field gel eletrophoresis) (Tenover et al., 1995) separa moléculas de ADN en geles de agarosa al someterlas a campos eléctricos que se alternan en dos direcciones. Para la electroforesis en gel por campo pulsado los aislamientos bacterianos se hacen crecer en un medio apropiado, preferiblemente líquido, y luego se combinan con agarosa fundida y se colocan en pequeños moldes. El resultado son bloques de agarosa que contienen las bacterias completas. Las bacterias de los bloques se someten a lisis in situ y luego el ADN libre e inmovilizado en el gel de agarosa se corta con una enzima de restricción que tenga baja frecuencia de corte en el genoma estudiado. Cuando el primer campo eléctrico se aplica al gel las moléculas se alargan en la dirección del campo y migran en el gel. El primer campo eléctrico se suprime y un segundo campo, formando algún ángulo con el primero, se activa. El ADN debe cambiar su conformación y reorientarse antes de que pueda migrar en la dirección del segundo campo eléctrico. El tiempo requerido para esta reorientación es muy sensible al tamaño de la molécula, moléculas más grandes tardan más tiempo en realinearse después de cambiar el campo, que moléculas más pequeñas. El tiempo que se mantiene activo cada campo se denomina pulso y su duración es una función del tamaño de las moléculas que se desean separar. 3.3.3.1. Preparación del ADN bacteriano Este procedimiento se realizó en 10 aislados de E. coli, productores de BLEEs, de origen intrahospitalario, obtenidos en el periodo comprendido entre Octubre y Noviembre de 2002 y cuyas principales características son las siguientes: Betalactamasas de espectro extendido 132 Aislado 218: Procedente de UVI, productor de SHV. Aislado 224: Procedente de Lactantes, productor de SHV. Aislado 227: Procedente de Cirugía B, productor de SHV. Aislado 235: Procedente de Cirugía B, productor de CTX-M9. Aislado 246: Procedente de Cirugía B, productor de CTX-M9. Aislado 248: Procedente de Oncología, productor de CTX-M9. Aislado 255: Procedente de Traumatología, productor de SHV. Aislado 258: Procedente de Lactantes, productor de CTX-M9. Aislado 260: Procedente de Médica II, productor de CTX-M9. Aislado 261: Procedente de Cirugía B, productor de SHV. Se realizaron cultivos en agar-sangre de los 10 aislados y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Posteriormente una única colonia se subcultivó en medio BHI (bioMérieux) y se dejó crecer durante 14-18 horas a 37°C. Las bacterias del cultivo se recolectaron por centrifugación a 4000 r.p.m. durante 10 minutos a temperatura ambiente y se resuspendieron en 2 ml de buffer PIV (1 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 7,6) Este contenido se mezcló con un volumen igual (500 µl) de agarosa al 1,7% y se distribuyó en moldes, dejándose gelificar a 4°C durante 10 minutos. Los bloques de agarosa resultantes se colocaron en tubos que contenían 4 ml de buffer de lisis (EC) (1M NaCl; 6mM Tris- HCl pH 7,6; 100 mM EDTA pH 7,0-7,5; 0,5% N-lauril sarcocinato de sodio; 0,2% Deoxycolato; 0,5% Brij-58; RNAasa 20 µg/ml y lisozima 1 mg/ml) y posteriormente se incubaron a 37°C durante toda la noche. Al día siguiente se decantó la solución EC y a continuación se desproteinizaron los bloques en solución ESP (1% N-lauril sarcocinato de sodio; 500 mM EDTA pH 8,0-9,0; Proteinasa K 50 µg/ml). Se mantuvieron a 50°C durante 24 h. 3. Material y métodos 133 Para remover los restos celulares y la proteinasa K los bloques se lavaron 3 veces con TE (10 mM Tris-HCl pH 7,6; 1 mM EDTA pH 8,0) durante 30 minutos a 37ºC. Después se almacenaron a 4°C en TE hasta la realización del campo pulsado. 3.3.3.2. Digestión con enzimas de restricción La digestión del DNA bacteriano se realizó con la enzima de restricción XbaI (MBI Fermentas, Estados Unidos). Para realizar la digestión, los bloques se lavaron con agua destilada durante 10 minutos a 37ºC. Posteriormente al lavado, y extraída el agua destilada, se añadió a los bloques de agarosa el buffer de la enzima de restricción y se mantuvieron a 37°C durante toda la noche. El proceso se repitió al día siguiente. Después se eliminó la solución de digestión y se puso TE a 37ºC durante 1 hora. 3.3.3.3. Electroforesis en campo pulsado El gel para la electroforesis en campo pulsado fue preparado con agarosa al 1,2% en TBE 0,5x (Tris 0,1 M; Acido Bórico 0,08 M; EDTA 0,1 mM) La electroforesis se corrió durante 22 horas con un pulso inicial de 2 segundos y un pulso final de 54 segundos (CHEF Mapper de BioRad, Estados Unidos). El voltaje fue de 6v/cm, buffer de corrido TBE 0,5x, refrigeración a 14°C. Betalactamasas de espectro extendido 134 3.4. Métodos estadísticos de análisis de los resultados ? Se utilizó la prueba exacta de Fisher para tablas r x s, que queda en tablas 2 x 2 en la prueba exacta clásica de Fisher, para comparar entre sí el grupo de aislados productores de BLEEs con el grupo de aislados no productores, y también el grupo de aislados productores de enzimas CTX-M9 con el grupo de aislados productores de SHV, en cuanto a las siguientes variables: 1. Variables demográficas: 1.1. Especie bacteriana aislada (E. coli, K. pneumoniae y K. oxytoca). 1.2. Sexo del paciente del que procede la muestra (mujer o varón). 1.3. Procedencia de la muestra (intrahospitalaria o extrahospitalaria). 1.4. Tipo de muestra (orina, exudado quirúrgico, secreción genital, escara/úlcera, sonda vesical y otras). 2. Variables de sensibilidad antibiótica: 2.1. Distribución de CMIs obtenidas mediante los sistemas automatizados VITEK 2 y WIDER para cada uno de los antibióticos ensayados (betalactámicos y no betalactámicos). 2.2. Categorías clínicas obtenidas mediante los sistemas automatizados VITEK 2 y WIDER para cada uno de los antibióticos ensayados (betalactámicos y no betalactámicos). En todos los casos se consideró como hipótesis nula (H 0 ) la ausencia de diferencias entre los grupos comparados en cuanto a la variable analizada, e hipótesis alternativa (H 1 ) la existencia de diferencia significativa entre los grupos en cuanto a la variable analizada. 3. Material y métodos 135 ? Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para comparar las distribuciones de las CMIs de los E-test en los dos grupos de aislados productores de BLEEs (CTX-M9 y SHV), resolviendo los valores extremos tomando la unidad inmediatamente inferior, si era un extremo inferior, y la inmediatamente superior si era un extremo superior. Se consideró hipótesis nula (H 0 ) la ausencia de diferencias entre los dos grupos de aislados productores de BLEEs en cuanto a la variable analizada, e hipótesis alternativa (H 1 ) la existencia de diferencia significativa entre ambos grupos en cuanto a la variable analizada. ? Se utilizó la prueba de Clopper-Pearson para una proporción para establecer los intervalos de confianza al 95% de los valores de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo de los diferentes métodos de detección de BLEEs. 4. RESULTADOS 4. Resultados 139 A los 469 aislados clínicos que constituyen el objeto de nuestro estudio (399 E. coli, 48 K. pneumoniae y 22 K. oxytoca) se le realizaron los diferentes métodos fenotípicos descritos previamente en el apartado Material y Métodos (método A, método B, E-test, VITEK 2 y WIDER) con la finalidad de identificar en ellos la producción de BLEEs. Se determinó que un aislamiento poseía una BLEE cuando cumplía los criterios ya descritos para el método A (apartado 3.2.1.), que hemos considerado como método de referencia para el estudio fenotípico. Se obtuvieron 125 aislados positivos, con un fenotipo compatible con la presencia de una BLEE (115 E. coli, 8 K. pneumoniae y 2 K. oxytoca) (figura 23) y 344 aislamientos negativos (284 E. coli, 40 K. pneumoniae y 20 K. oxytoca) (figura 24). Figura 23: Clasificación de los 125 aislados productores de BLEEs según la especie Figura 24: Clasificación de los 344 aislados no productores de BLEEs según la especie 92% 6% 2% E. coli K. pneumoniae K. oxytoca 82% 12% 6% E. coli K. pneumoniae K. oxytoca Betalactamasas de espectro extendido 140 4.1. Descripción fenotípica y caracterización bioquímica y molecular de los aislados productores de BLEEs En la tabla 25 mostramos los diámetros de los halos de inhibición del crecimiento bacteriano obtenidos para los métodos A y B en los 125 aislados productores de BLEEs, así como, en su caso, la presencia de sinergia del disco de la cefalosporina o el aztreonam con el disco de amoxicilina más ácido clavulánico en el método B, para cada aislado clínico y la especie bacteriana correspondiente. En la tabla 26 aparecen los resultados de CMI (Concentración Mínima Inhibitoria) expresados en µg/ml obtenidos para los dos procedimientos de E-test realizados, junto al cociente obtenido entre las CMIs de la cefalosporina sola (TZ y CT) y en asociación con ácido clavulánico (TZL y CTL), para cada aislado clínico productor de BLEE y la especie bacteriana correspondiente. Cabe destacar que en todos los aislamientos se obtuvo un cociente entre CMIs de la cefalosporina sola y de la cefalosporina con ácido clavulánico ? 8 (? 3 diluciones) en al menos uno de los dos E-test. El resultado ND obtenido en algunos de estos cocientes fue debido en todos los casos a que los valores de CMI para el E-test de la cefalosporina sola y en asociación con ácido clavulánico fueron inferiores a los límites inferiores de detección de CMI de los E-test. En la tabla 27 se detallan los valores de CMI obtenidos mediante el sistema VITEK 2 para los distintos antibióticos betalactámicos ensayados por el mismo, y en la tabla 28 se indican los valores de CMI para los antibióticos no betalactámicos, ambos en el grupo de aislamientos clínicos productores de BLEEs. En la tabla 29 se detallan los valores de CMI obtenidos mediante el sistema WIDER para los distintos antibióticos betalactámicos 4. Resultados 141 ensayados por el mismo en el grupo de aislamientos clínicos productores de BLEEs. A los 125 aislados que confirmaron la presencia de BLEEs por el método A se les realizó identificación de la betalactamasa hallada por isoelectroenfoque (figura 25) y determinación del gen responsable de su producción por PCR (figura 26). Estos resultados para cada aislado y su especie bacteriana se muestran en la tabla 30. Como se puede apreciar, se identificaron betalactamasas con pI 8.2 compatible con SHV (que se confirmó por PCR), 8.1 compatible con CTX-M9 (que se confirmó por PCR), 5.4 compatible en E. coli con TEM-1 y 7.6 compatible en K. pneumoniae con SHV-1. No se obtuvieron puntos isoeléctricos compatibles con enzimas tipo TEM-BLEE y no se confirmó presencia de ninguna enzima CTX-M10 (pI 8.1). Betalactamasas de espectro extendido 142 Tabla 25: Resultados obtenidos para los métodos fenotípicos A y B en los 125 aislados productores de BLEEs Diámetro del halo (en mm) Aislado Especie CAZ CD 02 CTX CD 03 CPD CD 01 ATM 1 E. coli 32 36 10 (S) 24 6 (S) 20 26 (S) 16 E. coli 12 (S) 28 21 (S) 34 10 (S) 26 14 (S) 19 K. pneumoniae 18 (S) 28 17 (S) 32 6 (S) 22 30 25 E. coli 21 (S) 30 14 (S) 30 6 (S) 17 25 (S) 26 E. coli 27 30 17 (S) 28 6 (S) 18 27 (S) 27 E. coli 26 30 19 (S) 30 6 (S) 20 28 31 K. pneumoniae 20 (S) 30 24 (S) 34 12 (S) 30 30 41 E. coli 23 28 18 (S) 30 6 (S) 20 24 (S) 42 E. coli 19 (S) 28 16 (S) 26 6 (S) 20 30 46 E. coli 15 (S) 30 8 (S) 30 6 (S) 20 17 (S) 47 E. coli 24 30 13 (S) 30 6 (S) 19 23 (S) 48 K. pneumoniae 20 (S) 30 12 (S) 30 6 (S) 20 20 (S) 51 E. coli 28 30 20 (S) 30 6 (S) 21 27 (S) 54 E. coli 18 (S) 32 14 (S) 32 6 (S) 22 20 (S) 56 E. coli 30 30 20 (S) 32 6 (S) 22 30 58 E. coli 28 30 22 (S) 28 6 (S) 22 30 62 E. coli 26 32 20 (S) 32 12 (S) 26 26 (S) 63 E. coli 28 30 16 (S) 28 6 (S) 20 26 (S) 65 E. coli 24 28 18 (S) 28 6 (S) 20 24 (S) 101 E. coli 6 (S) 30 14 (S) 34 6 (S) 26 6 (S) 102 E. coli 6 (S) 28 10 (S) 34 6 (S) 23 6 (S) 112 E. coli 26 34 10 (S) 34 6 (S) 24 24 (S) 115 E. coli 26 30 15 (S) 30 6 (S) 22 25 (S) 118 E. coli 6 (S) 29 14 (S) 34 6 (S) 23 6 (S) 121 E. coli 10 (S) 28 20 (S) 34 6 (S) 24 10 (S) 122 E. coli 27 30 19 (S) 32 6 (S) 23 27 (S) 124 E. coli 26 32 19 (S) 32 6 (S) 23 26 (S) 132 E. coli 25 30 12 (S) 32 6 (S) 21 25 (S) 134 E. coli 16 (S) 30 24 (S) 34 14 (S) 28 16 (S) 135 E. coli 18 (S) 23 12 (S) 24 6 (S) 20 16 (S) 136 E. coli 24 30 16 (S) 34 6 (S) 24 24 (S) 137 E. coli 26 32 18 (S) 32 6 (S) 23 26 (S) 138 E. coli 21 (S) 30 12 (S) 30 6 (S) 22 22 (S) 139 E. coli 26 29 16 (S) 29 6 (S) 18 26 (S) 140 E. coli 30 30 20 (S) 34 12 (S) 26 30 141 E. coli 26 32 14 (S) 32 10 (S) 24 26 (S) 145 E. coli 22 (S) 31 14 (S) 31 6 (S) 21 24 (S) 149 E. coli 26 30 14 (S) 29 6 (S) 19 26 (S) 150 E. coli 14 (S) 30 22 (S) 36 14 (S) 29 16 (S) 151 E. coli 24 30 16 (S) 30 6 (S) 20 12 (S) 153 E. coli 24 32 14 (S) 32 6 (S) 18 22 (S) 4. Resultados 143 Diámetro del halo (en mm) Aislado Especie CAZ CD 02 CTX CD 03 CPD CD 01 ATM 159 E. coli 28 30 16 (S) 30 6 (S) 16 26 (S) 161 E. coli 26 30 17 (S) 30 6 (S) 20 25 (S) 162 E. coli 8 (S) 26 20 (S) 31 6 (S) 24 8 (S) 163 E. coli 22 (S) 32 12 (S) 32 6 (S) 22 24 (S) 165 E. coli 24 25 16 (S) 25 6 (S) 16 24 169 E. coli 23 36 15 (S) 36 6 (S) 16 12 (S) 170 E. coli 15 (S) 24 8 (S) 24 6 (S) 13 14 (S) 171 E. coli 22 (S) 30 17 (S) 27 6 (S) 18 20 (S) 175 K. pneumoniae 10 (S) 25 14 (S) 30 6 (S) 23 20 (S) 177 E. coli 14 (S) 30 20 (S) 28 6 (S) 21 18 (S) 178 E. coli 20 (S) 30 16 (S) 34 12 (S) 24 16 (S) 179 E. coli 6 (S) 27 14 (S) 32 6 (S) 22 6 (S) 180 E. coli 14 (S) 24 22 (S) 28 10 (S) 20 20 (S) 181 E. coli 14 (S) 28 20 (S) 30 12 (S) 24 16 (S) 183 E. coli 10 (S) 30 22 (S) 34 10 (S) 26 14 (S) 184 K. pneumoniae 22 (S) 28 20 (S) 32 10 (S) 26 26 (S) 185 E. coli 30 34 14 (S) 34 6 (S) 23 26 (S) 186 E. coli 32 34 12 (S) 32 6 (S) 23 24 (S) 187 E. coli 30 34 18 (S) 34 6 (S) 25 26 189 E. coli 12 (S) 30 6 (S) 30 6 (S) 18 12 (S) 190 E. coli 18 (S) 34 14 (S) 34 6 (S) 26 16 (S) 191 E. coli 23 26 12 (S) 24 6 (S) 21 20 (S) 192 E. coli 24 34 20 (S) 30 6 (S) 22 26 (S) 193 E. coli 28 36 20 (S) 30 10 (S) 26 26 195 E. coli 26 28 20 (S) 30 6 (S) 23 30 196 E. coli 14 (S) 30 26 (S) 34 10 (S) 26 18 (S) 197 K. pneumoniae 22 (S) 34 22 (S) 34 17 (S) 30 15 198 E. coli 20 (S) 32 8 (S) 32 6 (S) 17 16 (S) 200 E. coli 20 (S) 26 14 (S) 25 6 (S) 15 10 (S) 204 E. coli 21 (S) 32 14 (S) 32 6 (S) 22 24 (S) 207 E. coli 26 30 18 (S) 32 6 (S) 24 24 (S) 208 E. coli 14 (S) 25 20 (S) 27 6 (S) 24 16 (S) 210 E. coli 24 26 18 (S) 28 6 (S) 19 26 (S) 211 E. coli 26 32 14 (S) 32 6 (S) 22 24 214 E. coli 12 (S) 27 22 (S) 28 6 (S) 24 16 (S) 215 K. oxytoca 18 (S) 30 19 (S) 32 6 (S) 23 16 (S) 217 E. coli 14 (S) 24 18 (S) 27 6 (S) 25 16 (S) 218 E. coli 10 (S) 27 16 (S) 30 6 (S) 20 10 (S) 219 E. coli 12 (S) 25 18 (S) 27 6 (S) 21 10 (S) 220 E. coli 14 (S) 32 20 (S) 34 13 (S) 28 16 (S) 221 E. coli 24 27 18 (S) 27 6 (S) 20 24 (S) 223 K. pneumoniae 20 (S) 30 19 (S) 36 6 (S) 26 24 (S) 224 E. coli 13 (S) 26 10 (S) 26 6 (S) 16 18 (S) Betalactamasas de espectro extendido 144 Diámetro del halo (en mm) Aislado Especie CAZ CD 02 CTX CD 03 CPD CD 01 ATM 226 E. coli 6 (S) 23 16 (S) 28 6 (S) 22 8 (S) 227 E. coli 10 (S) 20 16 (S) 26 6 (S) 19 32 228 E. coli 10 (S) 25 20 (S) 30 11 (S) 24 14 (S) 229 E. coli 10 (S) 27 20 (S) 29 6 (S) 23 14 (S) 230 E. coli 12 (S) 25 17 (S) 27 6 (S) 18 24 231 E. coli 16 (S) 24 24 (S) 27 6 (S) 20 30 232 E. coli 25 34 18 (S) 35 6 (S) 18 24 (S) 233 E. coli 22 (S) 32 14 (S) 32 6 (S) 23 20 (S) 235 E. coli 24 30 14 (S) 28 6 (S) 17 22 (S) 237 E. coli 28 30 20 (S) 30 6 (S) 21 10 (S) 240 E. coli 30 32 18 (S) 32 6 (S) 21 26 242 E. coli 16 (S) 26 20 (S) 30 6 (S) 23 14 (S) 245 E. coli 24 26 14 (S) 28 6 (S) 18 24 246 E. coli 29 30 22 (S) 30 6 (S) 20 24 (S) 248 E. coli 23 26 10 (S) 26 6 (S) 16 26 249 E. coli 16 (S) 30 20 (S) 30 13 (S) 25 16 (S) 252 K. pneumoniae 16 (S) 22 11 (S) 26 6 (S) 24 20 (S) 253 E. coli 28 30 16 (S) 28 6 (S) 18 26 254 E. coli 20 (S) 25 14 (S) 24 6 (S) 14 20 (S) 255 E. coli 16 (S) 30 22 (S) 30 12 (S) 26 16 (S) 258 E. coli 24 28 16 (S) 26 6 (S) 17 26 260 E. coli 20 (S) 35 12 (S) 35 6 (S) 24 28 261 E. coli 10 (S) 25 16 (S) 27 6 (S) 17 10 (S) 265 E. coli 14 (S) 26 20 (S) 30 10 (S) 24 14 (S) 266 E. coli 14 (S) 27 20 (S) 32 6 (S) 22 14 (S) 267 E. coli 14 (S) 28 20 (S) 34 13 (S) 26 14 (S) 268 E. coli 16 (S) 24 20 (S) 27 11 (S) 25 14 (S) 269 E. coli 24 28 12 (S) 27 6 (S) 20 20 (S) 270 E. coli 24 28 8 (S) 27 6 (S) 20 20 (S) 272 E. coli 12 (S) 25 12 (S) 28 6 (S) 23 14 (S) 273 E. coli 22 (S) 28 12 (S) 28 6 (S) 18 20 (S) 274 E. coli 26 29 14 (S) 30 6 (S) 21 20 (S) 276 E. coli 12 (S) 26 20 (S) 30 6 (S) 22 14 (S) 277 E. coli 14 (S) 23 0 (S) 24 6 (S) 20 12 (S) 280 E. coli 14 (S) 30 20 (S) 26 6 (S) 21 10 (S) 282 E. coli 23 23 6 (S) 24 6 (S) 21 20 (S) 283 K. oxytoca 10 (S) 26 8 (S) 26 6 (S) 16 20 (S) 284 E. coli 25 25 10 (S) 23 6 (S) 17 20 (S) 285 E. coli 11 (S) 26 6 (S) 25 6 (S) 17 16 (S) 288 E. coli 8 (S) 26 10 (S) 30 6 (S) 20 18 (S) 290 E. coli 24 26 14 (S) 26 6 (S) 15 22 (S) CAZ: Ceftazidima (30 µg), CD02: Ceftazidima más ácido clavulánico (30/10 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CD03: Cefotaxima más ácido clavulánico (30/10 µg), CPD: Cefpodoxima (10 µg), CD01: Cefpodoxima más ácido clavulánico (10/1 µg), ATM: Aztreonam (30 µg) (S): Sinergia en la zona cercana al disco de amoxicilina más ácido clavulánico de la cefalosporina o el aztreonam en el método B 4. Resultados 145 Tabla 26: Resultados obtenidos para los métodos de E-test en los 125 aislados productores de BLEEs (CMI en µg/ml) Aislado Especie CMI TZ CMI TZL CMI CT CMI CTL RATIO TZ/TZL RATIO CT/CTL 1 E. coli 1 0,38 >16 0,032 2,6 >500 16 E. coli >32 0,25 0,5 0,032 >128 15,6 19 K. pneumoniae 2 0,25 2 0,023 8 87 25 E. coli <0,50 0,064 >16 0,094 <7,8 >170 26 E. coli 0,5 0,094 >16 0,094 5,3 >170 27 E. coli <0,50 <0,064 2 0,016 ND 125 31 K. pneumoniae 1,5 0,19 0,38 0,023 7,9 16,5 41 E. coli 1 0,094 >16 0,023 10,6 >696 42 E. coli <0,50 0,125 12 0,047 <4 255 46 E. coli >32 0,25 >16 0,094 >128 >170 47 E. coli 1,5 0,064 >16 0,064 23,4 >250 48 K. pneumoniae 8 0,064 >16 0,023 125 >696 51 E. coli 0,75 0,064 >16 0,016 11,7 >1000 54 E. coli 4 0,064 >16 0,016 62,5 >1000 56 E. coli 0,75 0,064 >16 0,032 11,7 >500 58 E. coli <0,50 <0,064 12 <0,016 ND >750 62 E. coli <0,50 0,064 >16 0,032 <7,8 >500 63 E. coli 1 <0,064 >16 0,016 >15,6 >1000 65 E. coli 1,5 0,38 >16 0,047 3,9 >340 101 E. coli >32 0,125 >16 0,023 >256 >695 102 E. coli >32 0,19 >16 0,032 >168 >500 112 E. coli 1 <0,064 >16 0,016 >15,63 >1000 115 E. coli <0,50 0,094 >16 0,032 <5,3 >500 118 E. coli >32 0,125 >16 0,023 >256 >695 121 E. coli >32 0,19 >16 0,023 >168 >695 122 E. coli 0,75 0,125 3 0,032 6 93,75 124 E. coli 0,75 0,094 >16 0,016 7,9 >1000 132 E. coli <0,50 0,064 >16 0,032 <7,8 >500 134 E. coli 3 0,064 0,5 0,016 46,9 31,25 135 E. coli 4 0,125 >16 0,047 32 >340 136 E. coli <0,50 0,064 >16 0,032 <7,8 >500 137 E. coli 0,75 0,125 >16 0,19 6 >84,2 138 E. coli 0,75 0,125 >16 0,125 6 >128 139 E. coli 0,75 0,19 >16 0,094 3,9 >170 140 E. coli <0,50 0,094 >16 0,094 <5,3 >170 141 E. coli <0,50 0,094 >16 0,094 <5,3 >170 145 E. coli <0,50 0,125 >16 0,094 <4 >170 149 E. coli 0,5 0,094 >16 0,094 5,3 >170 150 E. coli 12 0,094 1 0,064 127,7 15,6 151 E. coli 0,75 0,19 >16 0,125 3,9 >128 153 E. coli 0,75 0,25 >16 0,38 3 >42 Betalactamasas de espectro extendido 146 Aislado Especie CMI TZ CMI TZL CMI CT CMI CTL RATIO TZ/TZL RATIO CT/CTL 159 E. coli 0,75 0,19 >16 0,38 3,9 >42 161 E. coli 0,75 0,19 >16 0,19 3,9 >84,2 162 E. coli >32 0,19 >16 0,094 >168 >170 163 E. coli 1 0,25 >16 0,125 4 >128 165 E. coli 0,5 0,19 >16 0,023 2,6 >695 169 E. coli 0,75 0,25 >16 0,064 3 >250 170 E. coli 4 0,19 >16 0,094 21,1 >170 171 E. coli 0,75 0,19 >16 0,094 3,9 >170 175 K. pneumoniae 8 0,064 2 0,023 125 87 177 E. coli 6 0,19 1 0,125 31,6 8 178 E. coli 0,75 0,19 >16 0,125 3,9 >128 179 E. coli >32 0,19 >16 0,064 >168 >250 180 E. coli 8 0,125 1 0,094 64 10,6 181 E. coli 8 0,125 1,5 0,094 64 16 183 E. coli 8 0,094 1,5 0,064 85,1 23,4 184 K. pneumoniae 1,5 0,094 3 0,032 15,9 93,7 185 E. coli <0,50 <0,064 >16 0,047 ND >340,4 186 E. coli <0,50 <0,064 >16 0,023 ND >695,6 187 E. coli <0,50 <0,064 6 0,016 ND 375 189 E. coli 16 0,125 >16 0,125 128 >128 190 E. coli 3 0,094 >16 0,094 31,9 >170 191 E. coli 0,75 0,094 >16 0,047 7,9 340 192 E. coli 0,5 0,125 >16 0,094 4 >170 193 E. coli 0,5 0,064 >16 0,023 7,8 >695,6 195 E. coli 1 <0,064 >16 0,032 >15,6 >500 196 E. coli 6 0,064 1 0,032 93 31,25 197 K. pneumoniae 0,5 0,064 1 0,016 7,8 62,5 198 E. coli 2 0,125 >16 0,094 16 >170 200 E. coli 1 0,19 >16 0,032 5,3 >500 204 E. coli 0,75 0,19 >16 0,064 3,9 >250 207 E. coli 0,75 0,125 >16 0,016 6 >1000 208 E. coli 12 0,094 1 0,023 128 43,5 210 E. coli 0,5 0,064 >16 0,032 7,8 >500 211 E. coli <0,50 0,094 >16 0,023 <5,3 >695,6 214 E. coli 12 0,064 1 0,016 187,5 62,5 215 K. oxytoca 1 0,064 4 0,032 15,6 125 217 E. coli 12 0,094 2 0,032 128 62,5 218 E. coli >32 0,125 >16 0,094 >256 >170 219 E. coli >32 0,125 >16 0,032 >256 >500 220 E. coli 8 <0,064 4 0,032 >125 125 221 E. coli <0,50 0,19 >16 0,023 <2,6 >695,6 223 K. pneumoniae 0,75 0,125 4 0,032 <5,3 125 224 E. coli 16 0,125 >16 0,125 128 >128 4. Resultados 147 Aislado Especie CMI TZ CMI TZL CMI CT CMI CTL RATIO TZ/TZL RATIO CT/CTL 226 E. coli >32 0,25 >16 0,016 >128 >1000 227 E. coli >32 0,19 >16 0,047 >168 >340 228 E. coli >32 0,19 1 0,032 >168 31,25 229 E. coli >32 0,19 1 0,023 >168 43,5 230 E. coli 0,5 0,064 6 <0,016 7,8 >375 231 E. coli 12 0,125 2 0,125 96 16 232 E. coli 0,75 0,19 >16 0,023 2,6 >695,6 233 E. coli 1 0,19 >16 0,016 5,3 >1000 235 E. coli 0,75 0,19 >16 0,047 3,9 >340 237 E. coli 6 0,25 >16 0,25 24 >64 240 E. coli <0,50 0,064 >16 0,023 <7,8 >695,6 242 E. coli >32 0,094 >16 0,032 >340 >500 245 E. coli 0,75 0,25 >16 0,047 3 >340 246 E. coli <0,50 0,125 >16 0,047 <4 >340 248 E. coli <0,50 0,094 >16 0,023 <5,3 >695,6 249 E. coli 16 0,064 1 0,016 250 62,5 252 K. pneumoniae 16 0,19 >16 0,023 84 >695,6 253 E. coli <0,50 <0,064 >16 0,023 ND >695,6 254 E. coli <0,50 0,094 >16 0,023 <5,3 >695,6 255 E. coli 12 0,064 1 0,023 187,5 43,5 258 E. coli 0,5 0,094 >16 0,016 5,3 >1000 260 E. coli 1 <0,064 >16 0,032 >15,6 >500 261 E. coli >32 0,25 >16 0,032 >128 >500 265 E. coli >32 0,19 1 0,016 >168 62,5 266 E. coli >32 0,19 1 0,023 >168 43,5 267 E. coli >32 0,125 1 <0,016 >256 >62,5 268 E. coli >32 0,125 3 0,032 >256 93,75 269 E. coli 0,5 0,125 >16 0,032 4 >500 270 E. coli 1,5 0,38 >16 0,094 3,9 >170 272 E. coli 16 <0,064 1 <0,016 >250 >62,5 273 E. coli <0,50 0,19 >16 <0,016 <2,6 >1000 274 E. coli <0,50 0,094 >16 0,047 <5,3 >340 276 E. coli >32 0,094 1,5 <0,016 >340 93,75 277 E. coli >32 0,094 >16 0,016 >340 >1000 280 E. coli >32 <0,064 1,5 <0,016 >500 93,75 282 E. coli 0,5 0,094 >16 0,016 5,3 >1000 283 K. oxytoca 1 0,094 >16 0,023 10,6 >695,6 284 E. coli 0,5 0,094 >16 0,016 5,3 >1000 285 E. coli 1 0,125 >16 0,016 8 >1000 288 E. coli 6 0,064 2 0,016 93 125 290 E. coli 0,75 0,094 >16 0,016 8 >1000 CMI: Concentración Mínima Inhibitoria TZ: Ceftazidima, TZL: Ceftazidima más ácido clavulánico, CT: Cefotaxima, CTL: Cefotaxima más ácido clavulánico RATIO TZ/TZL o CT/CTL: Cociente entre las CMIs de la cefalosporina sola (TZ o CT) y las CMIs de la cefalosporina más ácido clavulánico (TZL o CTL) ND: Resultado Indeterminado (CMIs inferiores a los límites inferiores) Betalactamasas de espectro extendido 148 Tabla 27: CMIs (en µg/ml) obtenidos mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos en los 125 aislados productores de BLEEs Aislado AM AMC PIP* TZP CF CXM FOX CTX CPD CAZ* FEP MEM 1 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 32 > 64 4 < 1 - > 22 < 0,25 16 > 32 4 64 8 > 64 32 8 < 1 > 8 16 < 1 < 0,25 19 > 32 4 > 128 < 4 > 64 16 < 4 4 > 8 4 < 1 < 0,25 25 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 16 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 26 > 32 8 > 128 < 4 > 64 > 64 16 16 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 27 > 32 4 64 < 4 > 64 > 64 < 4 4 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 31 > 32 4 64 < 4 > 64 8 < 4 2 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 41 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 42 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 46 > 32 16 > 128 8 > 64 > 64 32 > 64 > 8 16 8 < 0,25 47 > 32 4 > 128 8 > 64 > 64 32 > 64 > 8 2 2 < 0,25 48 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 8 2 < 0,25 51 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 54 > 32 16 > 128 8 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 4 2 < 0,25 56 > 32 8 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 58 > 32 4 32 < 4 > 64 > 64 < 4 4 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 62 > 32 > 32 > 128 64 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 63 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 65 > 32 8 > 128 < 4 > 64 > 64 16 > 64 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 101 > 32 8 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 > 64 2 < 0,25 102 > 32 16 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 > 64 > 64 < 0,25 112 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 2 32 < 0,25 115 > 32 16 > 128 < 4 > 64 > 64 16 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 118 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 8 16 > 8 > 64 2 < 0,25 121 > 32 8 > 128 < 4 > 64 32 < 4 32 > 8 > 64 < 1 < 0,25 122 > 32 8 64 < 4 > 64 > 64 8 > 64 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 124 > 32 8 32 < 4 > 64 > 64 8 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 132 > 32 8 32 < 4 > 64 > 64 8 16 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 134 > 32 < 2 32 < 4 > 64 8 < 4 < 1 > 8 8 < 1 < 0,25 135 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 16 > 8 16 2 < 0,25 136 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 137 > 32 8 > 128 < 4 > 64 > 64 8 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 138 > 32 4 64 < 4 > 64 > 64 < 4 16 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 139 > 32 > 32 > 128 64 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 140 > 32 8 64 < 4 > 64 > 64 < 4 4 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 141 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 8 32 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 145 > 32 8 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 149 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 150 > 32 < 2 32 < 4 > 64 8 < 4 2 > 8 16 < 1 < 0,25 151 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 8 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 153 > 32 16 > 128 < 4 > 64 > 64 16 > 64 > 8 2 2 < 0,25 4. Resultados 149 Aislado AM AMC PIP* TZP CF CXM FOX CTX CPD* CAZ* FEP MEM 159 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 16 16 > 8 < 1 - > 2 2 < 0,25 161 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 8 8 > 8 < 1 - > 2 2 < 0,25 162 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 > 64 < 1 < 0,25 163 > 32 4 32 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 2 2 < 0,25 165 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 16 > 8 < 1 - > 2 2 < 0,25 169 > 32 16 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 32 > 8 < 1 - > 2 < 1 < 0,25 170 > 32 16 > 128 8 > 64 > 64 8 > 64 > 8 16 32 < 0,25 171 > 32 < 2 64 < 4 > 64 > 64 < 4 8 4 < 1 - > 2 < 1 < 0,25 175 > 32 8 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 16 2 < 0,25 177 > 32 4 32 < 4 > 64 16 < 4 2 > 8 16 < 1 < 0,25 178 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 2 2 < 0,25 179 > 32 8 > 128 8 > 64 > 64 16 32 > 8 > 64 4 < 0,25 180 > 32 4 32 < 4 > 64 16 < 4 4 > 8 16 < 1 < 0,25 181 > 32 4 64 < 4 > 64 16 < 4 2 > 8 16 < 1 < 0,25 183 > 32 4 32 < 4 > 64 32 8 4 > 8 16 < 1 < 0,25 184 > 32 4 > 128 < 4 > 64 16 < 4 4 > 8 4 < 1 < 0,25 185 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 32 > 64 > 8 < 1 - > 2 32 < 0,25 186 > 32 8 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 2 2 < 0,25 187 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 2 < 1 < 0,25 189 > 32 16 > 128 8 > 64 > 64 16 > 64 > 8 16 8 < 0,25 190 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 16 < 0,25 - > 2 2 < 1 < 0,25 191 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 8 > 64 > 8 < 1 - > 2 2 < 0,25 192 > 32 16 > 128 < 4 > 64 > 64 8 8 > 8 < 1 - > 2 2 < 0,25 193 > 32 < 2 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 2 < 1 < 0,25 195 > 32 4 64 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 2 < 1 < 0,25 196 > 32 4 64 < 4 > 64 32 < 4 4 > 8 16 < 1 < 0,25 197 > 32 4 > 128 < 4 > 64 4 < 4 2 > 8 < 1 - > 2 < 1 < 0,25 198 > 32 16 > 128 < 4 > 64 > 64 32 > 64 > 8 4 > 64 < 0,25 200 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 8 8 > 8 < 1 - > 2 2 < 0,25 204 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 2 2 < 0,25 207 > 32 4 32 < 4 > 64 > 64 8 8 > 8 < 1 - > 2 < 1 < 0,25 208 > 32 4 32 < 4 > 64 32 8 2 > 8 16 < 1 < 0,25 210 > 32 8 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 2 < 1 < 0,25 211 > 32 8 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 2 < 1 < 0,25 214 > 32 4 32 < 4 > 64 16 8 4 > 8 16 < 1 < 0,25 215 > 32 < 2 8 - > 32 < 4 > 64 8 < 4 < 1 > 8 16 < 1 < 0,25 217 > 32 4 32 < 4 > 64 16 < 4 4 > 8 16 < 1 < 0,25 218 > 32 16 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 > 64 2 < 0,25 219 > 32 16 > 128 < 4 > 64 > 64 8 > 64 > 8 > 64 < 1 < 0,25 220 > 32 < 2 16 < 4 > 64 4 < 4 < 1 4 4 < 1 < 0,25 221 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 2 2 < 0,25 223 > 32 8 > 128 < 4 > 64 32 < 4 4 > 8 4 < 1 < 0,25 224 > 32 16 > 128 8 > 64 > 64 16 > 64 > 8 16 8 < 0,25 Betalactamasas de espectro extendido 150 Aislado AM AMC PIP* TZP CF CXM FOX CTX CPD CAZ* FEP MEM 226 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 > 64 < 1 < 0,25 227 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 > 64 2 < 0,25 228 > 32 4 32 < 4 > 64 16 < 4 4 > 8 16 < 1 < 0,25 229 > 32 4 32 < 4 > 64 16 < 4 2 > 8 16 < 1 < 0,25 230 > 32 4 32 < 4 > 64 > 64 < 4 4 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 231 > 32 4 32 < 4 > 64 32 8 4 > 8 16 < 1 < 0,25 232 > 32 16 > 128 32 > 64 > 64 16 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 233 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 16 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 235 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 16 8 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 237 > 32 8 > 128 8 > 64 > 64 > 64 > 64 > 8 4 16 < 0,25 240 > 32 4 32 < 4 > 64 > 64 < 4 16 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 242 > 32 4 64 < 4 > 64 16 8 8 > 8 16 < 1 < 0,25 245 > 32 8 > 128 < 4 > 64 > 64 16 16 > 8 2 2 < 0,25 246 > 32 4 64 < 4 > 64 > 64 < 4 2 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 248 > 32 4 32 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 249 > 32 16 32 < 4 > 64 16 < 4 8 > 8 16 < 1 < 0,25 252 > 32 8 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 16 2 < 0,25 253 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 254 > 32 4 32 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 255 > 32 4 32 < 4 > 64 16 16 4 > 8 16 < 1 < 0,25 258 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 16 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 260 > 32 4 32 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 261 > 32 16 > 128 < 4 > 64 16 8 4 > 8 16 < 1 < 0,25 265 > 32 8 > 128 < 4 > 64 32 < 4 4 > 8 32 < 1 < 0,25 266 > 32 8 64 < 4 > 64 32 < 4 4 > 8 16 < 1 < 0,25 267 > 32 < 2 32 < 4 > 64 16 < 4 8 > 8 16 < 1 < 0,25 268 > 32 8 > 128 < 4 > 64 32 < 4 4 > 8 16 < 1 < 0,25 269 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 270 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 8 > 64 > 8 < 1 - > 22 < 0,25 272 > 32 < 2 32 < 4 > 64 16 < 4 4 > 8 16 < 1 < 0,25 273 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 8 > 64 > 8 2 2 < 0,25 274 > 32 4 64 < 4 > 64 > 64 < 4 32 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 276 > 32 4 64 < 4 > 64 > 64 < 4 32 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 277 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 16 8 < 0,25 280 > 32 < 2 32 < 4 > 64 16 < 4 4 > 8 16 < 1 < 0,25 282 > 32 4 64 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 283 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 > 64 > 8 16 8 < 0,25 284 > 32 4 > 128 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 285 > 32 4 64 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 288 > 32 < 2 16 < 4 > 64 16 < 4 4 > 8 16 < 1 < 0,25 290 > 32 4 64 < 4 > 64 > 64 < 4 8 > 8 < 1 - > 2< 1 < 0,25 AM: Ampicilina, AMC: Amoxicilina-ácido clavulánico; PIP: Piperacilina; TZP: Piperacilina-tazobactam, CF: Cefalotina, CXM: Cefuroxima, FOX: Cefoxitina, CTX: Cefotaxima, CPD: Cefpodoxima, CAZ: Ceftazidima, FEP: Cefepime, MEM: Meropenem *Antibióticos en los que se modificó la CMI in vitro (en primer térmico) tras la interpretación del resultado obtenido 4. Resultados 151 Tabla 28: CMIs (en µg/ml) obtenidas mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos en los 125 aislados productores de BLEEs Aislado AN GM TM CIP NOR OFL FT SXT 1 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 > 320 16 16 8 > 16 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 19 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 32 < 20 25 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 26 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 27 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 32 > 320 31 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 128 < 20 41 < 2 4 2 > 4 > 16 > 8 64 < 20 42 < 2 > 16 2 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 46 4 > 16 > 16 > 4 > 16 > 8 64 > 320 47 < 2 < 1 < 1 2 8 4 128 < 20 48 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 32 < 20 51 < 2 < 1 < 1 < 0,25 2 2 < 16 < 20 54 8 > 16 > 16 > 4 > 16 > 8 32 > 320 56 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 > 320 58 < 2 < 1 < 1 > 4 8 > 8 < 16 > 320 62 < 2 < 1 < 1 < 0,25 2 2 < 16 > 320 63 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 < 20 65 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 < 20 101 < 2 > 16 > 16 > 4 > 16 > 8 32 < 20 102 < 2 > 16 > 16 > 4 > 16 > 8 32 < 20 112 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 < 20 115 < 2 > 16 > 16 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 118 < 2 8 > 16 > 4 > 16 > 8 64 < 20 121 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 32 > 320 122 < 2 > 16 2 2 2 > 8 64 < 20 124 < 2 < 1 < 1 2 4 4 64 > 320 132 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 128 > 320 134 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 < 20 135 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 > 320 136 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 > 320 137 < 2 > 16 8 > 4 > 16 > 8 32 < 20 138 < 2 < 1 < 1 1 2 4 32 > 320 139 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 > 320 140 < 2 < 1 < 1 > 4 8 > 8 < 16 > 320 141 < 2 < 1 < 1 > 4 8 > 8 < 16 > 320 145 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 > 320 149 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 < 20 150 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 < 20 151 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 > 320 153 < 2 > 16 > 16 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 Betalactamasas de espectro extendido 152 Aislado AN GM TM CIP NOR OFL FT SXT 159 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 161 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 < 20 162 < 2 > 16 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 32 > 320 163 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 < 20 165 < 2 < 1 < 1 1 2 2 32 < 20 169 < 2 < 1 < 1 1 1 2 32 < 20 170 < 2 > 16 8 > 4 > 16 > 8 64 < 20 171 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 1 64 > 320 175 < 2 > 16 > 16 < 0,25 < 0,5 < 0,25 64 < 20 177 < 2 4 8 > 4 > 16 > 8 32 > 320 178 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 < 20 179 < 2 > 16 8 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 180 < 2 4 8 > 4 > 16 > 8 32 > 320 181 < 2 4 8 > 4 > 16 > 8 32 > 320 183 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 184 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 64 < 20 185 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 128 < 20 186 < 2 < 1 < 1 1 2 2 < 16 > 320 187 < 2 < 1 < 1 < 0,25 1 2 64 > 320 189 8 > 16 > 16 > 4 > 16 > 8 256 < 20 190 < 2 < 1 < 1 2 2 4 < 16 > 320 191 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 192 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 > 320 193 < 2 < 1 < 1 0,5 1 1 < 16 > 320 195 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 < 20 196 < 2 8 8 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 197 < 2 > 16 8 < 0,25 < 0,5 < 0,25 32 < 20 198 < 2 < 1 < 1 1 2 2 128 > 320 200 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 > 320 204 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 < 20 207 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 > 320 208 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 210 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 > 320 211 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 < 20 214 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 < 20 215 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 32 < 20 217 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 218 < 2 > 16 8 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 < 20 219 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 < 20 220 < 2 < 1 < 1 < 0,25 1 1 < 16 > 320 221 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 > 320 223 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 32 < 20 224 8 > 16 > 16 > 4 > 16 > 8 32 > 320 4. Resultados 153 Aislado AN GM TM CIP NOR OFL FT SXT 226 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 < 20 227 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 < 20 228 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 229 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 230 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 231 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 < 20 232 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 > 320 233 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 < 20 235 < 2 < 1 < 1 1 2 2 < 16 < 20 237 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 240 < 2 < 1 < 1 > 4 8 > 8 256 > 320 242 < 2 < 1 < 1 < 0,25 2 2 64 < 20 245 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 > 320 246 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 32 > 320 248 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 249 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 252 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 64 > 320 253 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 > 320 254 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 > 320 255 < 2 > 16 2 > 4 > 16 > 8 64 < 20 258 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 260 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 128 > 320 261 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 < 20 265 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 266 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 267 < 2 < 1 < 1 > 4 8 > 8 128 40 268 < 2 < 1 < 1 1 2 2 128 > 320 269 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 > 320 270 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 272 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 > 320 273 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 < 20 274 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 276 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 277 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 280 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 128 < 20 282 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 > 320 283 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 < 16 < 20 284 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 > 320 285 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 32 > 320 288 < 2 < 1 < 1 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 16 < 20 290 < 2 < 1 < 1 > 4 > 16 > 8 64 > 320 AN: Amikacina, GM: Gentamicina, TM: Tobramicina, CIP: Ciprofloxacino, NOR: Norfloxacino, OFL: Ofloxacino, FT: Nitrofurantoína, SXT: Trimetoprim-sulfametoxazol Betalactamasas de espectro extendido 154 Tabla 29: CMIs (en µg/ml) obtenidos mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos en los 125 aislados productores de BLEEs Aislado AMX A/C P/T CF CFX CX CTX TAZ TZ/C CFP MER 1 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 >16 >8 >16 >8/4 >16 1 16 >16 16/8 <16/4 >8 >16 >16 >8 >16 8/4 >16 <1 19 >16 16/8 <16/4 >8 >16 >16 >8 4 <1/4 >16 <1 25 >16 16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 26 >16 8/4 <16/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 27 >16 16/8 <16/4 >8 >16 >16 >8 16 <1/4 >16 <1 31 >16 >16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 >8/4 >16 >8 41 >16 8/4 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 8/4 >16 <1 42 >16 16/8 64/4 >8 >16 16 >8 2 <1/4 >16 <1 46 >16 16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 47 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 8 >8 4 <1/4 >16 <1 48 >16 8/4 <16/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 51 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 16 >8 2 <1/4 >16 <1 54 >16 8/4 <16/4 >8 >16 >16 >8 8 <1/4 2 <1 56 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 >16 >8 1 <1/4 >16 <1 58 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 >16 >8 <1 <1/4 >16 <1 62 >16 16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 <1 <1/4 >16 <1 63 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 >16 >8 8 <1/4 >16 <1 65 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 >16 >8 16 <1/4 >16 <1 101 >16 16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 102 >16 16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 112 >16 8/4 <16/4 >8 >16 16 >8 8 <1/4 >16 <1 115 >16 16/8 64/4 >8 >16 16 >8 >16 <1/4 >16 <1 118 >16 16/8 >64/4 >8 >16 16 >8 >16 <1/4 >16 <1 121 >16 8/4 >64/4 >8 >16 16 >8 >16 <1/4 >16 <1 122 >16 8/4 <16/4 >8 >16 16 >8 2 <1/4 >16 <1 124 >16 8/4 >64/4 >8 >16 16 >8 16 <1/4 >16 <1 132 >16 8/4 <16/4 >8 >16 >16 >8 16 <1/4 >16 <1 134 >16 8/4 >64/4 >8 >16 16 >8 >16 <1/4 >16 <1 135 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 1 <1/4 >16 <1 136 >16 8/4 >64/4 >8 >16 16 >8 >16 <1/4 >16 <1 137 >16 16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 138 >16 >16/8 64/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 139 >16 16/8 64/4 >8 >16 16 >8 2 <1/4 >16 <1 140 >16 8/4 <16/4 >8 >16 16 >8 <1 <1/4 >16 <1 141 >16 >16/8 <16/4 >8 >16 >16 >8 8 <1/4 4 <1 145 >16 16/8 >64/4 >8 >16 16 >8 >16 <1/4 >16 <1 149 >16 >16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 16 <1/4 >16 <1 150 >16 8/4 <16/4 >8 >16 16 >8 >16 <1/4 >16 <1 151 >16 8/4 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 8/4 >16 <1 153 >16 >16/8 <16/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 4. Resultados 155 Aislado AMX A/C P/T CF CFX CX CTX TAZ TZ/C CFP MER 159 >16 8/4 64/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 161 >16 8/4 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 8/4 >16 <1 162 >16 16/8 >64/4 >8 >16 16 >8 >16 8/4 >16 <1 163 >16 8/4 <16/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 165 >16 8/4 <16/4 >8 >16 >16 >8 8 <1/4 >16 <1 169 >16 >16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 8/4 >16 <1 170 >16 >16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 8/4 >16 1 171 >16 16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 175 >16 16/8 <16/4 >8 >16 16 >8 >16 8/4 >16 1 177 >16 8/4 <16/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 178 >16 8/4 <16/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 179 >16 8/4 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 180 >16 >16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 181 >16 >16/8 >64/4 >8 >16 >16 >8 >16 8/4 >16 <1 183 >16 8/4 >64/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 184 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 8 <1/4 >16 <1 185 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 186 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 >16 <1 187 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 189 >16 8/4 <16/4 >8 >16 16 >8 >16 <1/4 >16 <1 190 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 4 <1/4 4 <1 191 >16 8/4 <16/4 >8 >16 16 >8 2 <1/4 >16 <1 192 >16 16/8 32/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 193 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 >16 <1 195 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 >16 <1 196 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 197 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 198 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 8 <1/4 >16 <1 200 >16 8/4 32/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 204 >16 >16/8 <16/4 >8 >16 >16 >8 8 8/4 >16 <1 207 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 >16 <1 208 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 4 <1 210 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 >16 <1 211 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 >16 <1 214 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 8 <1 215 >16 <4/2 >64/4 >8 16 >16 >8 <1 <1/4 <1 <1 217 >16 <4/2 <16/4 >8 16 <8 8 >16 <1/4 <1 <1 218 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 >16 <1 219 >16 16/8 >64/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 220 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 221 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 16 <1 223 >16 8/4 <16/4 >8 >16 16 >8 <1 <1/4 >16 <1 224 >16 <4/2 <16/4 >8 16 <8 >8 >16 <1/4 4 <1 Betalactamasas de espectro extendido 156 Aislado AMX A/C P/T CF CFX CX CTX TAZ TZ/C CFP MER 226 >16 8/4 <16/4 >8 >16 >16 >8 >16 <1/4 >16 <1 227 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 228 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 8 <1 229 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 8 <1 230 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 >16 <1 231 >16 >16/8 <16/4 >8 >16 >16 >8 >16 >8/4 2 <1 232 >16 16/8 >64/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 233 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 8 <1 235 >16 8/4 64/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 237 >16 >16/8 <16/4 >8 >16 >16 >8 <1 8/4 2 1 240 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 >16 <1 242 >16 8/4 <16/4 >8 8 <8 >8 16 <1/4 <1 <1 245 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 246 <4 <4/2 >64/4 >8 <4 >16 >8 8 <1/4 8 <1 248 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 4 <1 249 >16 16/8 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 16 <1 252 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 4 <1/4 16 <1 253 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 >16 <1 254 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 16 <1/4 >16 <1 255 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 258 >16 <4/2 >64/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 260 >16 >16/8 <16/4 >8 >16 >16 >8 8 8/4 >16 <1 261 >16 16/8 64/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 265 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 266 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 16 <1 267 >16 <4/2 <16/4 >8 16 <8 8 >16 <1/4 <1 <1 268 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 2 <1 269 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 270 >16 8/4 >64/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 272 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 2 <1 273 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 274 >16 16/8 <16/4 >8 >16 >16 >8 8 8/4 >16 <1 276 >16 16/8 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 277 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 >16 <1 280 >16 <4/2 <16/4 >8 16 <8 4 >16 <1/4 <1 <1 282 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 283 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 <1 <1/4 >16 <1 284 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 285 >16 16/8 32/4 >8 >16 <8 >8 16 <1/4 >16 <1 288 >16 <4/2 <16/4 >8 >16 <8 >8 >16 <1/4 8 <1 290 >16 8/4 <16/4 >8 >16 <8 >8 2 <1/4 >16 <1 AMX: Amoxicilina, A/C: Amoxicilina-ácido clavulánico; P/T: Piperacilina-tazobactam, CF: Cefalotina, CFX: Cefuroxima, CX: Cefoxitina, CTX: Cefotaxima, TAZ: Ceftazidima, TZ/C: Ceftazidima?ácido clavulánico, CFP: Cefepime, MER: Meropenem 4. Resultados 157 Tabla 30: Punto isoeléctrico (determinado por isoelectroenfoque) y gen plasmídico presente (determinado por PCR) en los 125 aislados productores de BLEEs Aislado Especie pI PCR 1 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 16 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 19 K. pneumoniae 8.2 + 7.6 SHV 25 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 26 E. coli 8.1 CTX-M9 27 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 31 K. pneumoniae 8.2 + 7.6 SHV 41 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 42 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 46 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 47 E. coli 8.1 CTX-M9 48 K. pneumoniae 8.2 + 7.6 SHV 51 E. coli 8.1 CTX-M9 54 E. coli 8.2 SHV 56 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 58 E. coli 8.1 CTX-M9 62 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 63 E. coli 8.1 CTX-M9 65 E. coli 8.1 CTX-M9 101 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 102 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 112 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 115 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 118 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 121 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 122 E. coli 8.1 CTX-M9 124 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 132 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 134 E. coli 8.2 SHV 135 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 136 E. coli 8.1 CTX-M9 137 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 138 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 139 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 140 E. coli 8.1 CTX-M9 141 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 145 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 149 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 150 E. coli 8.2 SHV 151 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 153 E. coli 8.1 CTX-M9 Betalactamasas de espectro extendido 158 Aislado Especie pI PCR 159 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 161 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 162 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 163 E. coli 8.1 CTX-M9 165 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 169 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 170 E. coli 8.1 CTX-M9 171 E. coli 8.1 CTX-M9 175 K. pneumoniae 8.2 SHV 177 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 178 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 179 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 180 E. coli 8.2 SHV 181 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 183 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 184 K. pneumoniae 8.2 + 7.6 SHV 185 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 186 E. coli 8.1 CTX-M9 187 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 189 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 190 E. coli 8,2 + 5,4 SHV 191 E. coli 8,1 + 5,4 CTX-M9 192 E. coli 8,1 CTX-M9 193 E. coli 8,1 + 5,4 CTX-M9 195 E. coli 8,1 + 5,4 CTX-M9 196 E. coli 8,2 + 5,4 SHV 197 K. pneumoniae 8,2 + 7,6 SHV 198 E. coli 8,1 + 5,4 CTX-M9 200 E. coli 8,1 + 5,4 CTX-M9 204 E. coli 8,1 + 5,4 CTX-M9 207 E. coli 8,1 CTX-M9 208 E. coli 8,2 + 5,4 SHV 210 E. coli 8,1 + 5,4 CTX-M9 211 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 214 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 215 K. oxytoca 8.2 SHV 217 E. coli 8.2 SHV 218 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 219 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 220 E. coli 8.2 SHV 221 E. coli 8.1 CTX-M9 223 K. pneumoniae 8.2 + 7.6 SHV 224 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 4. Resultados 159 Aislado Especie pI PCR 226 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 227 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 228 E. coli 8.2 SHV 229 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 230 E. coli 8.1 CTX-M9 231 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 232 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 233 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 235 E. coli 8.1 CTX-M9 237 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 240 E. coli 8.1 CTX-M9 242 E. coli 8.2 SHV 245 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 246 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 248 E. coli 8.1 CTX-M9 249 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 252 K. pneumoniae 8.2 + 7.6 SHV 253 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 254 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 255 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 258 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 260 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 261 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 265 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 266 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 267 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 268 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 269 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 270 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 272 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 273 E. coli 8.1 CTX-M9 274 E. coli 8.1 CTX-M9 276 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 277 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 280 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 282 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 283 K. oxytoca 8.2 SHV 284 E. coli 8.2 SHV 285 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 288 E. coli 8.2 + 5.4 SHV 290 E. coli 8.1 + 5.4 CTX-M9 Betalactamasas de espectro extendido 160 Figura 25: Resultados de la técnica de isoelectroenfoque Línea 1: Control de peso molecular (DNA molecular weight III de Boehringer Mannheim Laboratories, Alemania) Línea 2: Control positivo bla CTX-M9 Líneas 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, y 13: Aislados pertenecientes al estudio Línea 14: Control negativo (E.coli ATCC 25922 ) Línea 15: Blanco Figura 26: Resultados de PCR Línea 1: Aislado de control, con pI 8.2 y 5.4 Línea 2: Aislado perteneciente al estudio, con pI 8.2 Líneas 3, 4 y 7: Aislados pertenecientes al estudio, con pI 8.2 y 5.4 Línea 5: Aislado control, con pI 8.1 Línea 6: Blanco 4. Resultados 161 En las figuras 27 y 28 se observa el comportamiento de los aislados productores de BLEEs mediante los métodos fenotípicos A, B y E-test. A B Figura 27: Comportamiento según el método de referencia (A: discos con la cefalosporina sola, B: discos con la cefalosporina más ácido clavulánico) A B Figura 28: Comportamiento según el método B (A) y E-test (B) En la tablas 31 y 32 y en las figuras 29 a 31, se resumen los resultados obtenidos en las técnicas de isoelectroenfoque y PCR para los 125 aislados productores de BLEEs. Betalactamasas de espectro extendido 162 Tabla 31: Clasificación de los 125 aislados productores de BLEEs según especie y punto isoeléctrico de la betalactamasa presente pI 8.1 8.1 + 5.4 8.2 8.2 + 5.4 8.2 + 7.6 E. coli 23 44 9 39 0 K. pneumoniae 0 0 1 0 7 K. oxytoca 0 0 2 0 0 Figura 29: Distribución de los puntos isoeléctricos encontrados según la especie Figura 30: Clasificación de los 125 aislados productores de BLEEs por la betalactamasa encontrada 54% 46% CTX-M9 SHV 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 8.1 8.1 + 5.4 8.2 8.2 + 5.4 8.2 + 7.6 E. coli K. pneumoniae K. oxytoca 4. Resultados 163 Tabla 32: Clasificación de los 125 aislados productores de BLEEs por especie y betalactamasa encontrada E. coli K. pneumoniae K. oxytoca CTX-M9 67 0 0 SHV 48 8 2 Figura 31: Clasificación de los 125 aislados productores de BLEEs por especie y betalactamasa encontrada Como puede observarse en las tablas y figuras anteriores, existe un claro predominio entre los aislados clínicos, tanto productores como no productores de BLEEs de la especie E. coli, frente a K. pneumoniae y K. oxytoca, hecho que está en relación, como veremos más adelante, con el tipo de muestra clínica predominante en este estudio. Podemos constatar un predominio de la betalactamasa CTX-M9 frente a SHV (figura 30). Destacamos la presencia de enzimas CTX-M9 sólo en E. coli, mientras que enzimas SHV aparecen en las tres especies (tabla 32). En E. coli encontramos ambos tipos de BLEEs, y en Klebsiella spp. sólo hallamos enzimas SHV (figura 31). 0 10 20 30 40 50 60 70 E. coli K. pneumoniae K. oxytoca CTX-M9 SHV Betalactamasas de espectro extendido 164 4.2. Características demográficas de los aislados Las características demográficas referentes al sexo, tipo de muestra de la que se obtuvo el aislado y el servicio que solicitó el análisis de la muestra correspondiente, quedan resumidas de la siguiente forma: En las figuras 32 y 33 se refleja la distribución por sexos en los dos grupos analizados, pudiéndose apreciar que no existen diferencias a este respecto entre ambos. Hay que señalar el predominio, en los dos grupos, de muestras procedentes de mujeres, hecho que está en relación también al predominio de determinadas muestras clínicas, como veremos. Figura 32: Distribución por sexos de los 125 aislados productores de BLEEs Figura 33: Distribución por sexos de los 344 aislados no productores de BLEEs 67% 33% Mujer Varón 69% 31% Mujer Varón 4. Resultados 165 Las muestras clínicas de las que se obtuvieron los distintos aislados, tanto productores como no productores de BLEEs, aparecen en las tablas 33 y 34, así como en las figuras 34 y 35, respectivamente. Tabla 33: Clasificación de los 125 aislados productores de BLEEs por tipo de muestra Orina Exudado quirúrgico Secreción genital Sonda vesical Otros 108 9 3 2 3 Otros: Incluye 1 catéter, 1 esputo y 1 líquido ascítico Figura 34: Clasificación de los 125 aislados productores de BLEEs por tipo de muestra 0 20 40 60 80 100 120 ORINA E. QUIRUR. S. GENITAL SONDA VESICA L OTROS Betalactamasas de espectro extendido 166 Tabla 34: Clasificación de los 344 aislados no productores de BLEEs por tipo de muestra Orina Exudado quirúrgico Secreción genital Escara/úlcera 316 16 4 8 Figura 35: Clasificación de los 344 aislados no productores de BLEEs por tipo de muestra En ambos grupos la muestra clínica predominante, fuente de aislados para nuestro estudio, fue la orina. En líneas generales ésta es la muestra más frecuente en los laboratorios de Microbiología Clínica. La bacteria que más frecuentemente produce infección del tracto urinario es E. coli, y la ITU es más prevalente en mujeres que en varones. Estos postulados sostienen el hecho de que en nuestro estudio la muestra más frecuente sea la orina, la especie bacteriana más frecuente sea E. coli y el sexo femenino sea el más relevante. 0 50 100 150 200 250 300 350 ORINA E. QUIRÚRGICO S. GENITAL ESCARA/ÚLCERA 4. Resultados 167 Si analizamos la distribución de las muestras en los dos grupos en función del sexo (tablas 35 y 36 y figuras 36 y 37) podemos constatar, por tanto, el predominio del sexo femenino como fuente de aislados clínicos para nuestro estudio, que se produce a costa de la orina como muestra clínica más frecuente. Tabla 35: Distribución por sexos de las diferentes muestras donde se encontraron aislados productores de BLEEs Orina Exudado Secreción genital Sonda vesical Otros Varones 27 6 2 2 2 Mujeres 81 3 1 0 1 Otros: Incluye 1 catéter, 1 esputo y 1 líquido ascítico Figura 36: Distribución por sexos de las diferentes muestras donde se encontraron aislados productores de BLEEs 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ORINA E. QUIRUR. S. GENITAL SONDA VESICAL OTROS Varones Mujeres Betalactamasas de espectro extendido 168 Tabla 36: Distribución por sexos de las diferentes muestras donde se encontraron aislados no productores de BLEEs Orina Exudado quirúrgico Secreción genital Escara/úlcera Varones 92 12 0 8 Mujeres 224 4 4 0 Figura 37: Distribución por sexos de las diferentes muestras donde se encontraron aislados no productores de BLEEs Las muestras clínicas para este estudio se obtuvieron tanto del nivel extrahospitalario (procedentes de los Centros de Atención Primaria) como del nivel intrahospitalario (considerando como tales las muestras procedentes de pacientes ingresados más de 72 horas en cualquiera de los servicios médicos o quirúrgicos del Hospital ?San Cecilio?). La distribución de los aislados por servicio solicitante del estudio de infección, así como su procedencia hospitalaria o comunitaria para los dos grupos de nuestro estudio se muestran en las tablas 37 y 38 y en las figuras 38 a 41. 0 50 100 150 200 250 ORINA E. QUIRÚR. S. GENITAL ESCARA/ÚLCERA Varones Mujeres 4. Resultados 169 Tabla 37: Clasificación de los 125 aislados productores de BLEEs según el servicio solicitante Extrahospitalarias Intrahospitalarias Cirugía General Medicina Interna Pediatría Traumatología Otros 93 7 4 12 3 6 Otros: Incluye 1 Cardiología, 1 Nefrología, 1 Oncología, 1 UVI, 1 Urología, 1 Cirugía Vascular Figura 38: Clasificación de los aislados productores de BLEEs por el origen de las muestras Figura 39: Distribución de los aislados productores de BLEEs de origen intrahospitalario por servicio solicitante La distribución de los aisldados procedentes del servicio de Pediatría fue: 2 de Preescolares, 4 de Lactantes, 4 de RNP y 2 de UCI. 74% 26% Extrahospitalarias Intrahospitalarias 0 2 4 6 8 10 12 C. GENERAL M. INTERNA PEDIATRÍA TRAUMATOLOGÍA OTROS Betalactamasas de espectro extendido 170 Tabla 38: Clasificación de los 344 aislados no productores de BLEEs según el servicio solicitante Extrahospitalarias Intrahospitalarias Cirugía General Medicina Interna Pediatría Reanimación Cirugía vascular 264 12 36 24 4 4 Figura 40: Clasificación de los aislados no productores de BLEEs por el origen de las muestras Figura 41: Distribución de los aislados no productores de BLEEs de origen intrahospitalario por servicio solicitante La distribución de los aisldados procedentes del servicio de Pediatría fue: 16 de Lactantes y 8 de RNP. 77% 23% Extrahospitalarias Intrahospitalarias 0 5 10 15 20 25 30 35 40 C. GENERAL M. INTERNA PEDIATRÍA REANIMACIÓN C. VASCULAR 4. Resultados 171 De nuevo, en las figuras 42 a 45 observamos mayor frecuencia de aislados entre mujeres que en varones, tanto en muestras extra como intrahospitalarias, sin diferencias para el sexo entre ambos grupos. Figura 42: Distribución de aislados intrahospitalarios productores de BLEEs por sexos Figura 43: Distribución de aislados extrahospitalarios productores de BLEEs por sexos Figura 44: Distribución de aislados intrahospitalarios no productores de BLEEs por sexos Figura 45: Distribución de aislados extrahospitalarios no productores de BLEEs por sexos 44% 56% Varones Mujeres 27% 73% Varones Mujeres 50%50% Varones Mujeres 27% 73% Varones Mujeres Betalactamasas de espectro extendido 172 4.3. Resultados obtenidos mediante el método de referencia (método A) En las tablas 39 a 42 se resumen los resultados obtenidos para el método de difusión con disco usado como método fenotípico de referencia en nuestro estudio (método A). Indicamos los resultados de media, desviación estándar y rango de los diámetros de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos correspondientes, de todos los aislados productores de BLEEs, diferenciando los aislados que poseyeron una enzima CTX-M9 de los que poseyeron una enzima SHV, y el grupo de aislados no productores de BLEEs. Tabla 39: Media (en mm), desviación estándar y rango de los aislados productores de BLEEs para la difusión con disco (método A) CAZ CD02 CTX CD03 CPD CD01 Media 19,8 28,8 16,1 29,9 7,0 21,5 Desviación estándar 6,78 3,18 4,35 3,13 2,30 3,38 Rango 6-32 20 - 36 6 - 26 23 - 36 6 - 17 13-30 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CD02: Ceftazidima más ácido clavulánico (30/10 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CD03: Cefotaxima más ácido clavulánico (30/10 µg), CPD: Cefpodoxima (10 µg), CD01: Cefpodoxima más ácido clavulánico (10/1 µg) Los 125 aislados productores de BLEEs presentaron medias de los diámetros de inhibición del crecimiento de las cefalosporinas solas (CAZ, CTX, CPD) por debajo de los límites que el NCCLS establece como puntos de corte para sospechar una BLEE (22, 27 y 17, respectivamente). Al mismo tiempo se aprecia que las medias de los diámetros de inhibición del crecimiento de los discos de las cefalosporinas más ácido clavulánico (CD02, CD03, CD01) están incrementadas más de 5 mm respecto al diámetro de inhibición del disco con la cefalosporina sola. 4. Resultados 173 La mayor desviación estándar para CAZ, así como su amplio rango, con valores que superan el valor límite establecido por el NCCLS para este antibiótico nos indican que éste, analizado por sí sólo, no fue capaz de detectar la presencia de BLEEs en algunos de los aislados. Tabla 40: Media (en mm), desviación estándar y rango de los aislados productores de CTX-M9 para la difusión con disco (método A) CAZ CD02 CTX CD03 CPD CD01 Media 24,5 30 15,5 29,7 6,2 20,1 Desviación estándar 3,87 2,9 3,34 2,97 0,99 2,87 Rango 12-32 23 - 36 8 - 22 24 - 36 6 - 12 13 - 26 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CD02: Ceftazidima más ácido clavulánico (30/10 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CD03: Cefotaxima más ácido clavulánico (30/10 µg), CPD: Cefpodoxima (10 µg), CD01: Cefpodoxima más ácido clavulánico (10/1 µg) Los 67 aislados productores de CTX-M9 presentaron medias de los diámetros de inhibición del crecimiento alrededor de los discos de CTX y CPD inferiores a los límites establecidos por el NCCLS, con un incremento considerable cuando se asoció la presencia de ácido clavulánico (CD03 y CD01). Como se puede apreciar, no ocurrió lo mismo para CAZ, para la que, aunque algunos valores del diámetro se encontraron dentro de los límites de validez, otros, sin embargo, fueron superiores a 22 mm, por lo que este antibiótico no fue capaz, por sí solo, de detectar la presencia de enzimas CTX-M9, hecho que está en consonancia con la menor capacidad de hidrólisis de ceftazidima por las enzimas CTX-M9. Betalactamasas de espectro extendido 174 Tabla 41: Media (en mm), desviación estándar y rango de los aislados productores de SHV para la difusión con disco (método A) CAZ CD02 CTX CD03 CPD CD01 Media 14,3 27,4 16,8 30,2 7,9 23 Desviación estándar 5,13 2,94 5,20 3,29 2,95 3,3 Rango 6 - 27 20 - 34 6 - 26 23 - 36 6 - 17 16 - 30 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CD02: Ceftazidima más ácido clavulánico (30/10 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CD03: Cefotaxima más ácido clavulánico (30/10 µg), CPD: Cefpodoxima (10 µg), CD01: Cefpodoxima más ácido clavulánico (10/1 µg) Para los 58 aislados productores de SHV observamos que las medias de los diámetros de inhibición del crecimiento alrededor de los discos de cefalosporinas solas son, en todos los casos, inferiores a los límites establecidos por el NCCLS, con un importante incremento en la media de los diámetros de inhibición en los discos que también contienen ácido clavulánico. Aunque para CAZ el valor promedio está dentro de los límites establecidos, como vemos por su rango, algunos aislados presentaron valores superiores a 22 mm. Tabla 42: Media (en mm), desviación estándar y rango de los aislados no productores de BLEEs para la difusión con disco (método A) CAZ CD02 CTX CD03 CPD CD01 Media 27,7 30 32,2 33,3 25,1 25,4 Desviación estándar 2,98 3,23 3,42 3,48 5,7 5,78 Rango 20-35 23-36 25-40 26-40 6 - 34 6 - 34 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CD02: Ceftazidima más ácido clavulánico (30/10 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CD03: Cefotaxima más ácido clavulánico (30/10 µg), CPD: Cefpodoxima (10 µg), CD01: Cefpodoxima más ácido clavulánico (10/1 µg) 4. Resultados 175 Los aislados no productores de BLEEs se mostraron básicamente sensibles a las cefalosporinas, no encontrándose diferencias entre las medias de los diámetros de inhibición del crecimiento bacteriano entre los discos de cefalosporinas solas y los que contenían cefalosporinas más ácido clavulánico. Los diámetros de inhibición del crecimiento de K. pneumoniae ATCC 700603 alrededor de los discos fueron (en mm) 10/22 para CAZ/CD02, 20/28 para CTX/CD03, 11/21 para CPD/CD01 en todos los ensayos; y para E. coli ATCC 25922 fueron (en mm) 28/28 para CAZ/CD02, 30/30 para CTX/CD03, 24/24 para CPD/CD01 en todos los ensayos. 4.4. Resultados obtenidos mediante el método B En las tablas 43 a 46 se resumen los resultados obtenidos para el método B. Indicamos los resultados de media, desviación estándar y rango de los diámetros de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos correspondientes, de todos los aislados productores de BLEEs, diferenciando los aislados que poseyeron una enzima CTX-M9 de los que poseyeron una enzima SHV, y el grupo de aislados no productores de BLEEs. Tabla 43: Media (en mm), desviación estándar y rango de los aislados productores de BLEEs para la difusión con disco (método B) CAZ CTX CPD ATM Media 19,8 16,1 7,0 20,1 Desviación estándar 6,78 4,35 2,30 6,36 Rango 6 - 32 6 - 26 6 - 17 6 - 32 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CPD: Cefpodoxima (10 µg), ATM: Aztreonam (30 µg) Betalactamasas de espectro extendido 176 Tabla 44: Media (en mm), desviación estándar y rango de los aislados productores de CTX-M9 para la difusión con disco (método B) CAZ CTX CPD ATM Media 24,5 15,5 6,2 23,5 Desviación estándar 3,87 3,34 0,99 4,51 Rango 12 - 32 8 - 22 6 - 12 10 - 30 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CPD: Cefpodoxima (10 µg), ATM: Aztreonam (30 µg) Tabla 45: Media (en mm), desviación estándar y rango de los aislados productores de SHV para la difusión con disco (método B) CAZ CTX CPD ATM Media 14,3 16,8 7,9 16,2 Desviación estándar 5,13 5,20 2,95 5,94 Rango 6 - 27 6 - 26 6 - 17 6 - 32 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CPD: Cefpodoxima (10 µg), ATM: Aztreonam (30 µg) Tabla 46: Media (en mm), desviación estándar y rango de los aislados no productores de BLEEs para la difusión con disco (método B) CAZ CTX CPD ATM Media 27,7 32,2 25,1 32,9 Desviación estándar 2,98 3,42 5,7 3,97 Rango 20 - 35 25 - 40 6 - 34 25 - 43 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CPD: Cefpodoxima (10 µg), ATM: Aztreonam (30 µg) En la tabla 47 se puede observar qué aislados productores de BLEEs mostraron sinergia entre el disco de la cefalosporina sola o el aztreonan y el que contenía amoxicilina más ácido clavulánico. 4. Resultados 177 Tabla 47: Distribución de los 125 aislados productores de BLEEs según los resultados obtenidos para el diámetro de inhibición del crecimiento bacteriano para cada antibiótico ensayado y la presencia o no de sinergia con el método B Disco Diámetro Sinergia con clavulánico CTX-M9 SHV SI 17 54 ? 22 NO 0 0 CAZ > 22 No valoro 50 4 SI 67 58 ? 27 NO 0 0 CTX > 27 No valoro 0 0 SI 67 58 ? 17 NO 0 0 CPD > 17 No valoro 0 0 SI 50 53 ? 27 NO 7 4 ATM > 27 No valoro 10 1 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CPD: Cefpodoxima (10 µg), ATM: Aztreonam (30 µg) Al igual que ocurría con el método A, CTX y CPD presentaron medias de los diámetros de inhibición del crecimiento por debajo de los límites establecidos por el NCCLS, junto a presencia de sinergia en la asociación con ácido clavulánico en todos los aislados productores de BLEEs. Lo mismo ocurrió para ATM, con un límite establecido por el NCCLS en ? 27 mm, aunque en algunos aislados se superó este valor, por lo que no se muestra útil, por sí solo, para detectar la presencia de una BLEE. Al igual que en el método A, CAZ presentó en algunos aislados que contenían BLEEs valores superiores a su valor límite, especialmente entre los aislamientos productores de CTX-M9, donde su media superó el valor límite establecido, por lo que no se muestra útil, por sí sola, para detectar la presencia de una BLEE. Betalactamasas de espectro extendido 178 En los aislados no productores de BLEEs ninguno de estos cuatro antibióticos presentó medias de diámetros de inhibición del crecimiento inferiores a los límites establecidos, y aunque algunos aislados sí presentaron diámetros inferiores, en ningún caso se mostró sinergia en la asociación con ácido clavulánico (tabla 46). Los diámetros de inhibición del crecimiento de K. pneumoniae ATCC 700603 alrededor de los discos fueron (en mm) 10 para CAZ, 20 para CTX, 11 para CPD y 12 para ATM junto a sinergia con ácido clavulánico en todos los ensayos; y para E. coli ATCC 25922 fueron (en mm) 28 para CAZ, 30 para CTX, 24 para CPD y 32 para ATM en todos los ensayos. 4.5. Resultados del estudio con cefepime y cefoxitina En las tablas 48 a 51 mostramos los resultados de media, desviación estándar y rango de los diámetros de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos de cefepime (FEP) y cefoxitina (FOX), de todos los aislados productores de BLEEs, diferenciando los que poseyeron una enzima CTX-M9 de los que poseyeron una enzima SHV, y el grupo de aislados no productores de BLEEs. En la tabla 52 aparece la distribución de los aislados productores y no productores de BLEEs según el comportamiento in vitro respecto a cefepime y cefoxitina en los tres procedimientos que ensayaron estos antibióticos (difusión con disco, VITEK 2 y WIDER). En la tabla 53 aparece el comportamiento que cefepime y cefoxitina mostraron en la interpretación de los resultados fenotípicos al valorarse conjuntamente con los métodos A y B. 4. Resultados 179 Tabla 48: Media (en mm), desviación estándar y rango de los aislados productores de BLEEs para la difusión con disco con cefepime y cefoxitina FEP FOX Media 21,2 23,1 Desviación estándar 4,22 3,57 Rango 6 - 32 6 - 30 FEP: Cefepime (30 µg), FOX: Cefoxitina: (30 µg) Tabla 49: Media (en mm), desviación estándar y rango de los aislados productores de CTX-M9 para la difusión con disco con cefepime y cefoxitina FEP FOX Media 19,8 22 Desviación estándar 3,55 4,82 Rango 6 - 26 6 - 30 FEP: Cefepime (30 µg), FOX: Cefoxitina: (30 µg) Tabla 50: Media (en mm), desviación estándar y rango de los aislados productores de SHV para la difusión con disco con cefepime y cefoxitina FEP FOX Media 22,9 23,7 Desviación estándar 4,3 2,49 Rango 14 - 32 16 - 30 FEP: Cefepime (30 µg), FOX: Cefoxitina: (30 µg) Tabla 51: Media (en mm), desviación estándar y rango de los aislados no productores de BLEEs para la difusión con disco con cefepime y cefoxitina FEP FOX Media 32 22,9 Desviación estándar 3,27 4,98 Rango 24 - 40 8 - 32 FEP: Cefepime (30 µg), FOX: Cefoxitina: (30 µg) Betalactamasas de espectro extendido 180 Tabla 52: Distribución de los aislados clínicos productores y no productores de BLEEs según la categoría clínica obtenidos para cefepime y cefoxitina Método Categoría clínica Aislados productores de BLEEs Aislados no productores de BLEEs S (? 18) 108 344 I (15-17) 7 0 Difusión con disco R (? 14) 10 0 S (? 8) 119 344 I (16) 1 0 VITEK 2 R (? 32) 5 0 S (? 8) 21 308 I (16) 4 16 CEFEPIME WIDER R (? 32) 100 20 S (? 18) 118 284 I (15-17) 2 24 Difusión con disco R (? 14) 5 36 S (? 8) 106 252 I (16) 13 32 VITEK 2 R (? 32) 6 60 S (? 8) 62 68 I (16) 19 84 CEFOXITINA WIDER R (? 32) 44 192 Total 125 344 Tabla 53: Interpretación de los resultados obtenidos para cefepime y cefoxitina en la difusión con disco (diámetro del halo de inhibición en mm) Número de aislados con fenotipo compatible con la presencia de BLEEs Cefepime Cefoxitina Compatible No compatible ? 18 (sensible) 105 284 ? 18 (sensible) < 18 (resistente) 3 60 ? 18 (sensible) 13 0 < 18 (resistente) < 18 (resistente) 4 0 Total de aislamientos ensayados 125 344 4. Resultados 181 4.6. Resultados obtenidos mediante la prueba de Epsilon La distribución, en números absolutos, de las CMIs obtenidas mediante E-test para ceftazidima (TZ/TZL) y cefotaxima (CT/CTL) en los aislados productores de BLEEs, diferenciando los productores de CTX-M9 de los de SHV, y los no productores de BLEEs, se muestran en las figuras 46 a 53. Podemos observar que las CMIs más elevadas para TZ (? 2 µg/ml), aparecen básicamente en los aislados productores de SHV, encontrándose valores inferiores al punto de corte establecido por el NCCLS para ceftazidima fundamentalmente entre los productores de CTX-M9, como corresponde a una menor capacidad de hidrólisis de esta enzima por esta cefalosporina (figura 46). CT, sin embargo, presenta CMIs elevadas (? 2 µg/ml) para los aislados productores tanto de CTX- M9 como de SHV, si bien las CMIs más bajas se dan dentro del grupo de productores de SHV (figura 50). El análisis obtenido de las CMIs para las cefalosporinas asociadas con ácido clavulánico con el E-test (TZL y CTL) para los dos grupos de aislados productores de BLEEs nos muestra una clara disminución de los valores de CMIs de éstos respecto al E-test con la cefalosporina sola (TZ y CT, respectivamente), junto con una distribución más homogénea de CMIs en los dos grupos (figuras 48 y 52). En los aislados no productores de BLEEs las CMIs de TZ y CT se mostraron fundamentalmente en valores por debajo del límite establecido por el NCCLS para el cribado de BLEEs, por lo que no tiene utilidad en estos casos valorar los resultados obtenidos para las asociaciones con ácido clavulánico. En los casos en los que la CMI de las cefalosporinas solas fueron iguales o superiores a este valor límite, no se apreció una reducción de la CMI en la asociación con ácido clavulánico ? 8 (? 3 diluciones) (figuras 47 y 51). Betalactamasas de espectro extendido 182 Figura 46: Distribución de CMIs de TZ mediante E-test de los aislados productores de BLEEs Figura 47: Distribución de CMIs de TZ mediante E-test de los aislados no productores de BLEEs 22 1 9 5 20 1 8 3 3 2 1 1 2 2 1 2 2 6 6 5 23 0 5 10 15 20 25 <0,50 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 6 8 12 16 >32 TZ de los aislados CTX-M9 TZ de los aislados SHV 284 20 20 4 12 00000 4 00 0 50 100 150 200 250 300 <0,50 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 6 8 12 16 >32 4. Resultados 183 Figura 48: Distribución de CMIs de TZL mediante E-test de los aislados productores de BLEEs Figura 49: Distribución de CMIs de TZL mediante E-test de los aislados no productores de BLEEs 10 3 10 12 14 12 10 14 15 12 5 5 3 0 5 10 15 20 25 30 <0,064 0,064 0,094 0,125 0,19 0,25 0,38 TZL de los aislados CTX-M9 TZL de los aislados SHV 28 52 60 44 68 24 24 12 88 4 12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 <0,064 0,064 0,094 0,125 0,19 0,25 0,38 0,5 0,75 1,5 2 >4 Betalactamasas de espectro extendido 184 Figura 50: Distribución de CMIs de CT mediante E-test de los aislados productores de BLEEs Figura 51: Distribución de CMIs de CT mediante E-test de los aislados no productores de BLEEs 14 60 27 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 <0,25 0,25 0,38 0,5 1 1,5 2 3 4 6 12 >16 CT de los aislados CTX-M9 CT de los aislados SHV 296 16 12 12 00 8 0 50 100 150 200 250 300 350 <0,25 0,25 0,38 0,5 1 1,5 2 4. Resultados 185 Figura 52: Distribución de CMIs de CTL mediante E-test de los aislados productores de BLEEs Figura 53: Distribución de CMIs de CTL mediante E-test de los aislados no productores de BLEEs 3 4 10 12 11 13 10 15 9 1 3 3 12 6 4 4 2 1 2 0 5 10 15 20 25 <0,016 0,016 0,023 0,032 0,047 0,064 0,094 0,125 0,19 0,25 0,38 CTL de los aislados CTX-M9 CTL de los aislados SHV 36 24 76 40 60 20 28 16 8 4444 20 0 10 20 30 40 50 60 70 80 <0,016 0,016 0,023 0,032 0,047 0,064 0,094 0,125 0,19 0,25 0,38 0,5 0,75 >1 Betalactamasas de espectro extendido 186 En la tabla 54 aparecen los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos a partir de los E-test realizados en el conjunto de los 125 aislados clínicos productores de BLEEs. En la tabla 55 mostramos los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos a partir de los E-test realizados en el conjunto de los 67 aislados clínicos productores de CTX-M9. En la tabla 56 se recogen los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos a partir de los E-test realizados en el conjunto de los 58 aislados clínicos productores de SHV. En la tabla 57 se muestran los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos a partir de los E-test realizados en el conjunto de los 344 aislados clínicos no productores de BLEEs. La distribución de los resultados de CMI para cada E-test, en porcentaje respecto al total de cada grupo, quedan reflejados en las figuras 54 a 69. Al igual que ocurría con los métodos fenotípicos anteriores (método A y B) cabe destacar que en los aislados productores de BLEEs los valores de CMI obtenidos para ceftazidima (TZ) son inferiores al valor límite establecido por el NCCLS, hecho que ocurre a expensas fundamentalmente de una CMI baja para esta cefalosporina en los aislados productores de CTX-M9, no así para los aislados productores de SHV, con CMI superiores. Los valores de CMI para cefotaxima, sin embargo, son elevados para cualquiera de los dos grupos de aislados productores de BLEEs. La cepa de referencia K. pneumoniae ATCC 700603 presentó las siguientes CMIs: TZ > 32 µg/ml, TZL = 0,25 µg/ml, CT > 16 µg/ml y CTL = 0,25 µg/ml en todos los ensayos, mientras que E. coli ATCC 25922 presentó las CMIs: TZ < 0,50 µg/ml, TZL = 0,125 µg/ml, CT <0,25 µg/ml y CTL = 0,064 µg/ml en todos los ensayos. 4. Resultados 187 Tabla 54: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) mediante E-test para los aislados productores de BLEEs TZ TZL CT CTL CMI 50 1 0,125 >16 0,032 CMI 90 >32 0,25 >16 0,125 Figura 54: Distribución de CMIs de TZ mediante E-test para los aislados productores de BLEEs Figura 55: Distribución de CMIs de TZL mediante E-test para los aislados productores de BLEEs 18% 10% 18% 9% 5% 5% 4% 18% 2% 3% 4% 2% 2% <0,50 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 6 8 12 16 >32 10% 18% 21% 19% 22% 8% 2% <0,064 0,064 0,094 0,125 0,19 0,25 0,38 Betalactamasas de espectro extendido 188 Figura 56: Distribución de CMIs de CT mediante E-test para los aislados productores de BLEEs Figura 57: Distribución de CMIs de CTL mediante E-test para los aislados productores de BLEEs 1% 12% 3% 5% 2% 2% 2% 2% 69% 2% 0,38 0,5 1 1,5 2 3 4 6 12 >16 18% 19% 19% 8% 5% 14% 6% 2% 1% 2% 6% <0,016 0,016 0,023 0,032 0,047 0,064 0,094 0,125 0,19 0,25 0,38 4. Resultados 189 Tabla 55: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) mediante E-test para los aislados productores de CTX-M9 TZ TZL CT CTL CMI 50 0,75 0,094 >16 0,032 CMI 90 1,5 0,25 >16 0,125 Figura 58: Distribución de CMIs de TZ mediante E-test de los aislados productores de CTX-M9 Figura 59: Distribución de CMIs de TZL mediante E-test de los aislados productores de CTX-M9 34% 13% 30% 12% 4% 1% 3% 3% <0,50 0,5 0,75 1 1,5 2 4 6 15% 15% 21% 15% 23% 7% 4% <0,064 0,064 0,094 0,125 0,19 0,25 0,38 Betalactamasas de espectro extendido 190 Figura 60: Distribución de CMIs de CT mediante E-test de los aislados productores de CTX-M9 Figura 61: Distribución de CMIs de CTL mediante E-test de los aislados productores de CTX-M9 91% 1%1% 1% 3% 3% 1 2 3 6 12 >16 4% 15% 17% 15% 13% 4% 19% 6% 3% 1% 3% <0,016 0,016 0,023 0,032 0,047 0,064 0,094 0,125 0,19 0,25 0,38 4. Resultados 191 Tabla 56: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de E-test para los aislados productores de SHV TZ TZL CT CTL CMI 50 12 0,125 4 0,032 CMI 90 >32 0,25 >16 0,125 Figura 62: Distribución de CMIs de TZ mediante E-test de los aislados productores de SHV Figura 63: Distribución de CMIs de TZL mediante E-test de los aislados productores de SHV 2% 9% 2% 5% 3% 2% 3% 2% 3% 10% 10% 9% 40% <0,050 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 6 8 12 16 >32 5% 21% 21% 23% 21% 9% <0,064 0,064 0,094 0,125 0,19 0,25 Betalactamasas de espectro extendido 192 Figura 64: Distribución de CMIs de CT mediante E-test de los aislados productores de SHV Figura 65: Distribución de CMIs de CTL mediante E-test de los aislados productores de SHV 2% 3% 24% 7% 9% 3% 5% 47% 0,38 0,5 1 1,5 2 3 4 >16 7% 21% 22% 26% 2% 5% 10% 7% <0,016 0,016 0,023 0,032 0,047 0,064 0,094 0,125 4. Resultados 193 Tabla 57: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de E-test para los aislados no productores de BLEEs TZ TZL CT CTL CMI 50 <0,5 0,125 <0,25 0,032 CMI 90 0,75 0,5 0,25 0,25 Figura 66: Distribución de CMIs de TZ mediante E-test para los aislados no productores de BLEEs Figura 67: Distribución de CMIs de TZL mediante E-test para los aislados no productores de BLEEs 83% 6% 3% 1%1% 6% <0,50 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 6 8 12 16 >32 8% 15% 18% 13% 21% 7% 7% 2% 2% 3% 1%3% <0,064 0,064 0,094 0,125 0,19 0,25 0,38 0,5 0,75 1,5 2 >4 Betalactamasas de espectro extendido 194 Figura 68: Distribución de CMIs de CT mediante E-test para los aislados no productores de BLEEs Figura 69: Distribución de CMIs de CTL mediante E-test para los aislados no productores de BLEEs 87% 5% 3% 3% 2% <0,25 0,25 0,38 0,5 1 1,5 2 10% 7% 23% 12% 17% 6% 8% 5% 1% 1% 2% 1% 1% 6% <0,016 0,016 0,023 0,032 0,047 0,064 0,094 0,125 0,19 0,25 0,38 0,5 0,75 >1 4. Resultados 195 De los 125 aislados productores de BLEEs cumplieron criterios de detección de estas betalactamasas con el E-test TZ/TZL el 51%, no detectándose en el 49% de los casos (figura 70). Sin embargo, en el 100% de los aislados de este grupo se pudo detectar la presencia de una BLEE con el E-test CT/CTL (figura 71). En el 5% de estos aislados el E- test TZ/TZL se mostró con valores por debajo del límite inferior de detección y por tanto con resultado ND (figura 70). Éstos correspondieron con aislados que expresaban una enzima CTX-M9 y que presentaban también valores de ceftazidima sensible en los métodos fenotípicos anteriores (aislados 27, 58, 185, 186, 187 y 253). Como ningún aislado presentó CMIs superiores a los límites superiores de detección de los E-test, no hubo indicación de realizar E- test PM/PML. Figura 70: Distribución del cociente TZ/TZL en los aislados productores de BLEEs Figura 71: Distribución del cociente CT/CTL en los aislados productores de BLEEs 51% 44% 5% TZ/TZL = 8 TZ/TZL < 8 TZ/TZL = ND CT/CTL = 8 Betalactamasas de espectro extendido 196 Como se ve en las figuras 72 y 73, en el grupo de aislamientos productores de CTX-M9 la mejor prueba de Epsilon para detectar la presencia de las mismas es el E-test CT/CTL, que detectó el 100% de los aislados, mientras que el E-test TZ/TZL sólo pudo detectar el 21%. El 9% de aislados que presentaron un resultado ND fueron aquellos que, como anteriormente se ha dicho, poseían una enzima CTX-M9 y expresaron sensibilidad a ceftazidima en todos los métodos fenotípicos. Figura 72: Distribución del cociente TZ/TZL en los aislados productores de CTX-M9 Figura 73: Distribución del cociente CT/CTL en los aislados productores de CTX-M9 21% 70% 9% TZ/TZL = 8 TZ/TZL < 8 TZ/TZL = ND CT/CTL = 8 4. Resultados 197 Asimismo, en el grupo de aislados productores de SHV el E-test CT/CTL fue capaz de identificar la presencia de la enzima en el 100% de los casos, mientras que el E-test TZ/TZL lo hizo en el 86% de los aislados (figuras 74 y 75). Estos resultados sobre la capacidad del E-test de ceftazidima para detectar la presencia de BLEEs en nuestros aislados es acorde con los resultados obtenidos para otros métodos fenotípicos previamente valorados en este estudio. Figura 74: Distribución del cociente TZ/TZL en los aislados productores de SHV Figura 75: Distribución del cociente CT/CTL en los aislados productores de SHV 86% 14% TZ/TZL = 8 TZ/TZL < 8 CT/CTL = 8 Betalactamasas de espectro extendido 198 Entre los aislados no productores de BLEEs se puede observar que no existió ningún caso que cumpliese los criterios de detección de BLEEs por E-test (figuras 76 y 77). El 92% y el 90% de los aislados presentaron cocientes TZ/TZL y CT/CTL, respectivamente, inferiores a 8 (< 3 diluciones). En los respectivos porcentajes del 8% y 10% en los que el resultado fue ND se debió a que las CMIs para cada pareja de E-test fueron inferiores a los límites inferiores de detección de las tiras de E- test. Como ningún aislado presentó CMIs superiores a los límites superiores de detección de los E-test, no hubo indicación de realizar E- test PM/PML. Figura 76: Distribución del cociente TZ/TZL en los aislados no productores de BLEEs Figura 77: Distribución del cociente CT/CTL en los aislados no productores de BLEEs 8% 92% TZ/TZL < 8 TZ/TZL = ND 10% 90% CT/CTL < 8 CT/CTL = ND 4. Resultados 199 4.7. Resultados obtenidos mediante VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos estudiados En la tabla 58 aparecen los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos en los 125 aislados clínicos productores de BLEEs según los valores obtenidos in vitro, previos a la modificación posterior sugerida, en su caso, por el sistema AES. La distribución de los resultados de CMI para cada antibiótico betalactámico, en porcentaje respecto al total de este grupo, quedan reflejados en las figuras 78 a 89. Esto mismo se muestra en la tabla 59 para los antibióticos betalactámicos en los 67 aislados clínicos productores de CTX-M9 según los valores obtenidos in vitro, previos a la modificación posterior sugerida, en su caso, por el sistema AES. La distribución de los resultados de CMI para cada antibiótico betalactámico, en porcentaje respecto al total de este grupo, quedan reflejados en las figuras 90 a 101. Y en la tabla 60 se recogen los resultados para los antibióticos betalactámicos en los 58 aislados clínicos productores de SHV según los valores obtenidos in vitro, previos a la modificación posterior sugerida, en su caso, por el sistema AES. La distribución de los resultados de CMI para cada antibiótico betalactámico, en porcentaje respecto al total de este grupo, quedan reflejados en las figuras 102 a 113. En la tabla 61 se muestran los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos en los 344 aislados clínicos no productores de BLEEs según los valores obtenidos in vitro, previos a la modificación posterior sugerida, en su caso, por el sistema AES. La distribución de los resultados de CMI para cada antibiótico betalactámico, en porcentaje respecto al total de este grupo, quedan reflejados en las figuras 114 a 125. Betalactamasas de espectro extendido 200 Tabla 58: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de antibióticos betalactámicos mediante el sistema VITEK 2 para los aislados productores de BLEEs (resultados in vitro) CMI 50 CMI 90 AM > 32 > 32 AMC 4/2 16/8 PIP > 128 > 128 TZP < 4/4 8/4 CF > 64 > 64 CXM > 64 > 64 FOX < 4 16 CTX 8 > 64 CPD > 8 > 8 CAZ < 1 16 FEP < 1 4 MEM < 0,25 < 0,25 Una vez interpretado el resultado por el sistema AES, éste sugirió modificaciones para los siguientes antibióticos (tabla 27): Piperacilina: Modificación en un aislado que pasa de CMI = 8 µg/ml a CMI >32 µg/ml. El aislado poseía una enzima SHV. Cefpodoxima: Modificación en un aislado que pasa de CMI <0,25 µg/ml a CMI >2 µg/ml. El aislado poseía una enzima SHV. Ceftazidima: Modificación en 67 aislados que pasaron de CMI <1 µg/ml a CMI >2 µg/ml. 58 de estos aislados presentaron una enzima CTX-M9 y 9 aislados poseían una SHV. Estas modificaciones provocaron cambios en la emisión del informe respecto a la categoría clínica definitiva de cada antibiótico, como veremos. 4. Resultados 201 Figura 78: Distribución de la CMI de ampicilina (AM) en los aislados productores de BLEEs Figura 79: Distribución de la CMI de amoxicilina-ácido clavulánico (AMC) en los aislados productores de BLEEs Figura 80: Distribución de la CMI de piperacilina (PIP) en los aislados productores de BLEEs >32 8% 59% 18% 13% 2% <2/1 4/2 8/4 16/8 > 32/16 21% 14% 62% 1% 2% <4 8 16 32 64 >128 Betalactamasas de espectro extendido 202 Figura 81: Distribución de la CMI de piperacilina-tazobactam (TZP) en los aislados productores de BLEEs Figura 82: Distribución de la CMI de cefalotina (CF) en los aislados productores de BLEEs Figura 83: Distribución de la CMI de cefuroxima (CXM) en los aislados productores de BLEEs 90% 7% 1% 2% <4/4 8/4 32/4 64/4 >64 3% 14% 8% 73% 2% <1 2 4 8 16 32 >64 4. Resultados 203 Figura 84: Distribución de la CMI de cefoxitina (FOX) en los aislados productores de BLEEs Figura 85: Distribución de la CMI de cefotaxima (CTX) en los aislados productores de BLEEs Figura 86: Distribución de la CMI de cefpodoxima (CPD) en los aislados productores de BLEEs 67% 18% 10% 4% 1% <4 8 16 32 >64 3% 6% 18% 10% 5% 29% 29% <1 2 4 8 16 32 >64 1% 2% 97% <0,25 0,5 1 2 4 >8 Betalactamasas de espectro extendido 204 Figura 87: Distribución de la CMI de ceftazidima (CAZ) en los aislados productores de BLEEs Figura 88: Distribución de la CMI de cefepime (FEP) en los aislados productores de BLEEs Figura 89: Distribución de la CMI de meropenem (MEM) en los aislados productores de BLEEs 53% 26% 4% 6% 2% 8% 1% <1 2 4 8 16 32 >64 52% 38% 4% 2% 2% 1% 1% <1 2 4 8 16 32 >64 <0,25 4. Resultados 205 Tabla 59: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de antibióticos betalactámicos mediante el sistema VITEK 2 para los aislados productores de CTX-M9 (resultados in vitro) CMI 50 CMI 90 AM > 32 > 32 AMC 4/2 16/8 PIP > 128 > 128 TZP < 4/4 < 4/4 CF > 64 > 64 CXM > 64 > 64 FOX < 4 16 CTX 16 > 64 CPD > 8 > 8 CAZ < 1 2 FEP 2 2 MEM < 0,25 < 0,25 Betalactamasas de espectro extendido 206 Figura 90: Distribución de la CMI de ampicilina (AM) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 91: Distribución de la CMI de amoxicilina-ácido clavulánico (AMC) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 92: Distribución de la CMI de piperacilina (PIP) en los aislados productores de CTX-M9 >32 65% 21% 10% 1% 3% <2/1 4/2 8/4 16/8 >32/16 16% 13% 71% <4 8 16 32 64 >128 4. Resultados 207 Figura 93: Distribución de la CMI de piperacilina-tazobactam (TZP) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 94: Distribución de la CMI de cefalotina (CF) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 95: Distribución de la CMI de cefuroxima (CXM) en los aislados productores de CTX-M9 >64 99% 1% <1 2 4 8 16 32 >64 94% 1% 1% 4% <4/4 8/4 32/4 64/4 Betalactamasas de espectro extendido 208 Figura 96: Distribución de la CMI de cefoxitina (FOX) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 97: Distribución de la CMI de cefotaxima (CTX) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 98: Distribución de la CMI de cefpodoxima (CPD) en los aislados productores de CTX-M9 59% 21% 13% 6% 1% <4 8 16 32 >64 3% 6% 34% 15% 4% 38% <1 2 4 8 16 32 >64 97% 3% <0,25 0,5 1 2 4 >8 4. Resultados 209 Figura 99: Distribución de la CMI de ceftazidima (CAZ) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 100: Distribución CMI de cefepime (FEP) en aislados productores de CTX-M9 Figura 101: Distribución de CMI de meropenem (MEM) en los aislados productores de CTX-M9 87% 6% 3% 4% <1 2 4 8 16 32 >64 39% 55% 4% 1% 1% <1 2 4 8 16 32 >64 100% <0,25 Betalactamasas de espectro extendido 210 Tabla 60: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de antibióticos betalactámicos mediante el sistema VITEK 2 para los aislados productores de SHV (resultados in vitro) CMI 50 CMI 90 AM > 32 > 32 AMC 4/2 16/8 PIP > 128 > 128 TZP < 4/4 8/4 CF > 64 > 64 CXM 32 > 64 FOX < 4 8 CTX 8 > 64 CPD > 8 > 8 CAZ 16 > 64 FEP < 1 8 MEM < 0,25 < 0,25 4. Resultados 211 Figura 102: Distribución de la CMI de ampicilina (AM) en los aislados productores de SHV Figura 103: Distribución de la CMI de amoxicilina-ácido clavulánico (AMC) en los aislados productores de SHV Figura 104: Distribución de la CMI de piperacilina (PIP) en los aislados productores de SHV >32 14% 52% 16% 16% 2% <2/1 4/2 8/4 16/8 >32/16 3% 26% 16% 53% 2% <4 8 16 32 64 >128 Betalactamasas de espectro extendido 212 Figura 105: Distribución de la CMI de piperacilina-tazobactam (TZP) en los aislados productores de SHV Figura 106: Distribución de la CMI de cefalotina (CF) en los aislados productores de SHV Figura 107: Distribución de la CMI de cefuroxima (CXM) en los aislados productores de SHV 10% 88% 2% <4/4 8/4 32/4 64/4 >64 7% 28% 45% 17% 3% <1 2 4 8 16 32 >64 4. Resultados 213 Figura 108: Distribución de la CMI de cefoxitina (FOX) en los aislados productores de SHV Figura 109: Distribución de la CMI de cefotaxima (CTX) en los aislados productores de SHV Figura 110: Distribución de la CMI de cefpodoxima (CPD) en los aislados productores de SHV 75% 16% 7% 2% <4 8 16 32 >64 7% 10% 32% 24% 3% 5% 19% <1 2 4 8 16 32 >64 96% 2% 2% <0,25 0,5 1 2 4 >8 Betalactamasas de espectro extendido 214 Figura 111: Distribución de la CMI de ceftazidima (CAZ) en los aislados productores de SHV Figura 112: Distribución de la CMI de cefepime (FEP) en los aislados productores de SHV Figura 113: Distribución de la CMI de meropenem (MEM) en los aislados productores de SHV 16% 2% 9% 3% 51% 2% 17% <1 2 4 8 16 32 >64 68% 19% 2% 9% 2% <1 2 4 8 16 32 >64 <0,25 4. Resultados 215 Tabla 61: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de antibióticos betalactámicos mediante el sistema VITEK 2 para los aislados no productores de BLEEs (resultados in vitro) CMI 50 CMI 90 AM > 32 > 32 AMC 4/2 > 32/16 PIP 16 > 128 TZP < 4/4 8/4 CF 16 > 64 CXM 4 32 FOX < 4 32 CTX < 1 < 1 CPD < 0,25 2 CAZ < 1 < 1 FEP < 1 < 1 MEM < 0,25 < 0,25 Betalactamasas de espectro extendido 216 Figura 114: Distribución de la CMI de ampicilina (AM) en los aislados no productores de BLEEs Figura 115: Distribución de la CMI de amoxicilina-ácido clavulánico (AMC) en los aislados no productores de BLEEs Figura 116: Distribución de la CMI de piperacilina (PIP) en los aislados no productores de BLEEs 7% 6% 5% 8% 74% <2 4 8 16 >32 23% 9% 13% 10% 45% <2/1 4/2 8/4 16/8 >32/16 36% 6% 16% 6% 14% 22% <4 8 16 32 64 >128 4. Resultados 217 Figura 117: Distribución de la CMI de piperacilina-tazobactam (TZP) en los aislados no productores de BLEEs Figura 118: Distribución de la CMI de cefalotina (CF) en los aislados no productores de BLEEs Figura 119: Distribución de la CMI de cefuroxima (CXM) en los aislados no productores de BLEEs 2% 10% 88% <4/4 8/4 32/4 64/4 49% 3% 23% 8% 5% 6% 6% <1 2 4 8 16 32 >64 10% 20% 6% 29% 13% 22% <2 4 8 16 32 >64 Betalactamasas de espectro extendido 218 Figura 120: Distribución de la CMI de cefoxitina (FOX) en los aislados no productores de BLEEs Figura 121: Distribución de la CMI de cefotaxima (CTX) en los aislados no productores de BLEEs Figura 122: Distribución de la CMI de cefpodoxima (CPD) en los aislados no productores de BLEEs 69% 5% 9% 8% 9% <4 8 16 32 >64 99% 1% <1 2 4 8 16 32 >64 60% 12% 3% 17% 2% 6% <0,25 0,5 1 2 4 >8 4. Resultados 219 Figura 123: Distribución de la CMI de ceftazidima (CAZ) en los aislados no productores de BLEEs Figura 124: Distribución de la CMI de cefepime (FEP) en los aislados no productores de BLEEs Figura 125: Distribución de la CMI de meropenem (MEM) en los aislados no productores de BLEEs 2% 1% 97% <1 2 4 8 16 32 >64 <1 <0,25 Betalactamasas de espectro extendido 220 En las tablas 62, 64, 66 y 68 y figuras 126, 128, 130 y 132, se muestran las distribuciones de las categorías clínicas (S: sensible, I: intermedio y R: resistente) obtenidas mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos en los aislados productores de BLEEs, distinguiendo los que poseyeron una enzima CTX-M9 de los que poseyeron una SHV, y de los aislados no productores de BLEEs, antes que el sistema experto AES realizara las modificaciones necesarias en las mismas una vez establecido el fenotipo de resistencia para estos antibióticos (BLEE o no BLEE) en cada aislado clínico. En las tablas 63, 65, 67 y 69 y figuras 127, 129, 131 y 133, reflejamos las distribuciones de las categorías clínicas (S: sensible, I: intermedio y R: resistente) emitidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos en los aislados productores de BLEEs, distinguiendo los que poseyeron una enzima CTX-M9 de los que poseyeron una SHV, y de los aislados no productores de BLEEs, después que el sistema experto AES realizó las modificaciones necesarias en las mismas una vez establecido el fenotipo de resistencia para estos antibióticos en cada aislado clínico. Como puede observarse, los antibióticos betalactámicos ensayados por el sistema VITEK 2 que fueron modificados tras la interpretación del fenotipo obtenido en los aislados productores de BLEEs fueron piperacilina, cefuroxima, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima y cefepime. En todos los casos el sistema AES modificó aquellos aislados con categoría clínica sensible e informó estos antibióticos como resistentes limitando su uso clínico. 4. Resultados 221 Tabla 62. Categorías clínicas obtenidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos antes de la interpretación del resultado fenotípico por el sistema AES (antibióticos ensayados, no inferidos) para los aislados productores de BLEEs S I R AM 0 0 125 AMC 107 16 2 PIP 3 44 78 TZP 122 3 0 CF 0 0 125 CXM 6 17 102 FOX 106 13 6 CTX 71 18 36 CPD 1 3 121 CAZ 81 33 11 FEP 119 1 5 MEM 125 0 0 Figura 126: Distribución de los aislados productores de BLEEs según las categorías clínicas obtenidas in vitro mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos 125 107 16 2 3 44 78 122 3 125 6 17 102 106 13 6 71 18 36 1 3 121 81 33 11 119 1 5 125 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AM AMC PIP TZP CF CXM FOX CTX CPD CAZ FEP MEM S I R Betalactamasas de espectro extendido 222 Tabla 63: Categorías clínicas emitidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos tras la interpretación del resultado fenotípico por el sistema AES (antibióticos ensayados, no inferidos) para los aislados productores de BLEEs S I R AM 0 0 125 AMC 107 16 2 PIP 0 1 124 TZP 122 3 0 CF 0 0 125 CXM 0 0 125 FOX 106 13 6 CTX 0 0 125 CPD 0 0 125 CAZ 0 0 125 FEP 2 0 123 MEM 125 0 0 Figura 127: Distribución de los aislados productores de BLEEs según las categorías clínicas emitidas mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos 125 107 16 2 1 124 122 3 125 125 106 13 6 125 125 125 2 123 125 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AM AMC PIP TZP CF CXM FOX CTX CPD CAZ FEP MEM S I R 4. Resultados 223 Tabla 64: Categorías clínicas obtenidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos antes de la interpretación del resultado fenotípico por el sistema AES (antibióticos ensayados, no inferidos) para los aislados productores de CTX-M9 S I R AM 0 0 67 AMC 59 7 1 PIP 0 20 47 TZP 65 2 0 CF 0 0 67 CXM 0 0 67 FOX 53 9 5 CTX 29 13 25 CPD 0 2 65 CAZ 64 3 0 FEP 62 1 4 MEM 67 0 0 Figura 128: Distribución de los aislados productores de CTX-M9 según las categorías clínicas obtenidas in vitro mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos 67 59 7 1 20 47 65 2 67 67 53 9 5 29 13 25 2 65 64 3 62 1 4 67 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMAMCPIP TZP CF CXMFOXCTXCPDCAZ FEPMEM S I R Betalactamasas de espectro extendido 224 Tabla 65: Categorías clínicas emitidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos tras la interpretación del resultado fenotípico por el sistema AES (antibióticos ensayados, no inferidos) para los aislados productores de CTX-M9 S I R AM 0 0 67 AMC 59 7 1 PIP 0 0 67 TZP 65 2 0 CF 0 0 67 CXM 0 0 67 FOX 53 9 5 CTX 0 0 67 CPD 0 0 67 CAZ 0 0 67 FEP 1 0 66 MEM 67 0 0 Figura 129: Distribución de los aislados productores de CTX-M9 según las categorías clínicas emitidas mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos 67 59 7 1 67 65 2 67 67 53 9 5 67 67 67 1 66 67 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AM AMC PIP TZP CF CXM FOX CTX CPD CAZ FEP MEM S I R 4. Resultados 225 Tabla 66: Categorías clínicas obtenidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos antes de la interpretación del resultado fenotípico por el sistema AES (antibióticos ensayados, no inferidos) para los aislados productores de SHV S I R AM 0 0 58 AMC 48 9 1 PIP 3 24 31 TZP 57 1 0 CF 0 0 58 CXM 6 16 36 FOX 53 4 1 CTX 42 5 11 CPD 1 1 56 CAZ 17 30 11 FEP 57 0 1 MEM 58 0 0 Figura 130: Distribución de los aislados productores de SHV según las categorías clínicas obtenidas in vitro mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos 58 48 9 1 3 24 31 57 1 58 6 16 36 53 4 1 42 5 11 1 1 56 17 30 11 57 1 58 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AM AMC PIP TZP CF CXM FOX CTX CPD CAZ FEP MEM S I R Betalactamasas de espectro extendido 226 Tabla 67: Categorías clínicas emitidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos tras la interpretación del resultado fenotípico por el sistema AES (antibióticos ensayados, no inferidos) para los aislados productores de SHV S I R AM 0 0 58 AMC 48 9 1 PIP 0 1 57 TZP 57 1 0 CF 0 0 58 CXM 0 0 58 FOX 53 4 1 CTX 0 0 58 CPD 0 0 58 CAZ 0 0 58 FEP 1 0 57 MEM 58 0 0 Figura 131: Distribución de los aislados productores de SHV según las categorías clínicas emitidas mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos 58 48 9 1 1 57 57 1 58 58 53 4 1 58 58 58 1 57 58 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AM AMC PIP TZP CF CXM FOX CTX CPD CAZ FEP MEM S I R 4. Resultados 227 Tabla 68: Categorías clínicas obtenidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos antes de la interpretación del resultado fenotípico por el sistema AES (antibióticos ensayados, no inferidos) para los aislados no productores de BLEEs S I R AM 60 28 256 AMC 264 44 36 PIP 192 76 76 TZP 336 8 0 CF 124 100 120 CXM 224 80 40 FOX 252 32 60 CTX 344 0 0 CPD 316 8 20 CAZ 344 0 0 FEP 344 0 0 MEM 344 0 0 Figura 132: Distribución de los aislados no productores de BLEEs según las categorías clínicas obtenidas in vitro mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos 60 28 256 264 44 36 192 76 76 336 8 124 100 120 224 80 40 252 32 60 344 316 8 20 344 344 344 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AM AMC PIP TZP CF CXM FOX CTX CPD CAZ FEP MEM S I R Betalactamasas de espectro extendido 228 Tabla 69: Categorías clínicas emitidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos tras la interpretación del resultado fenotípico por el sistema AES (antibióticos ensayados, no inferidos) para los aislados no productores de BLEEs S I R AM 60 8 276 AMC 232 44 68 PIP 172 72 100 TZP 336 8 0 CF 124 100 120 CXM 224 68 52 FOX 252 32 60 CTX 332 0 12 CPD 312 8 24 CAZ 332 0 12 FEP 332 0 12 MEM 344 0 0 Figura 133: Distribución de los aislados no productores de BLEEs según las categorías clínicas emitidas mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos 60 8 276 232 44 68 172 72 100 336 8 124 100 120 224 68 52 252 32 60 332 12 312 8 24 332 12 332 12 344 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AM AMC PIP TZP CF CXM FOX CTX CPD CAZ FEP MEM S I R 4. Resultados 229 La cepa de referencia K. pneumoniae (ATCC 700603) se mostró en todos los ensayos in vitro resistente a ampicilina, piperacilina, cefoxitina, cefpodoxima y ceftazidima, y sensible a amoxicilina-ácido clavulánico, piperacilina-tazobactam, cefotaxima, cefepime y carbapenémicos (Rasheed et al., 2000). E. coli ATCCC 25922 fue sensible a todos los antibióticos ensayados. 4.8. Resultados obtenidos mediante VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos estudiados En la tabla 70 aparecen los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos en los 125 aislados clínicos productores de BLEEs. En la tabla 71 mostramos los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos en los 67 aislados clínicos productores de CTX-M9. En la tabla 72 se recogen los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos en los 58 aislados clínicos productores de SHV. En la tabla 73 se muestran los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos en los 344 aislados clínicos no productores de BLEEs. La distribución de los resultados de CMI para cada antibiótico, en porcentaje respecto al total de cada grupo, quedan reflejados en las figuras 134 a 165. Betalactamasas de espectro extendido 230 Tabla 70: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de los antibióticos no betalactámicos mediante el sistema VITEK 2 para los aislados productores de BLEEs (resultados in vitro) CMI 50 CMI 90 AN < 2 < 2 GM < 1 > 16 TM < 1 8 CIP > 4 > 4 NOR > 16 > 16 OFL > 8 > 8 FT 32 64 SXT > 320 > 320 Figura 134: Distribución de la CMI de amikacina (AN) en los aislados productores de BLEEs Figura 135: Distribución de la CMI de gentamicina (GM) en los aislados productores de BLEEs 1% 1% 2% 96% <2 4 8 16 81% 14% 2% 3% <1 2 4 8 >16 4. Resultados 231 Figura 136: Distribución de la CMI de tobramicina (TM) en los aislados productores de BLEEs Figura 137: Distribución de la CMI de ciprofloxacino (CIP) en los aislados productores de BLEEs Figura 138: Distribución de la CMI de norfloxacino (NOR) en los aislados productores de BLEEs 81% 3% 7% 9% <1 2 4 8 >16 26% 1% 64% 6% 3% <0,25 0,5 1 2 >4 22% 5% 60% 1% 9% 3% <0,5 1 2 4 8 >16 Betalactamasas de espectro extendido 232 Figura 139: Distribución de la CMI de ofloxacino (OFL) en los aislados productores de BLEEs Figura 140: Distribución de la CMI de nitrofurantoína (FT) en los aislados productores de BLEEs Figura 141: Distribución de la CMI de trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) en los aislados productores de BLEEs 21% 2% 8% 3%66% <0,25 1 2 4 >8 40% 21% 30% 2% 7% <16 32 64 128 256 49% 50% 1% <20 40 >320 4. Resultados 233 Tabla 71: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de los antibióticos no betalactámicos mediante el sistema VITEK 2 para los aislados productores de CTX-M9 (resultados in vitro) CMI 50 CMI 90 AN < 2 < 2 GM < 1 4 TM < 1 2 CIP > 4 > 4 NOR > 16 > 16 OFL > 8 > 8 FT < 16 64 SXT > 320 > 320 Figura 142: Distribución de la CMI de amikacina (AN) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 143: Distribución de la CMI de gentamicina (GM) en los aislados productores de CTX-M9 <2 9% 3% 88% <1 2 4 8 >16 Betalactamasas de espectro extendido 234 Figura 144: Distribución de la CMI de tobramicina (TM) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 145: Distribución de la CMI de ciprofloxacino (CIP) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 146: Distribución de la CMI de norfloxacino (NOR) en los aislados productores de CTX-M9 89% 3%4% 4% <1 2 4 8 >16 16% 1% 9% 4% 70% <0,25 0,5 1 2 >4 14% 4% 10% 1% 7% 64% <0,5 1 2 4 8 >16 4. Resultados 235 Figura 147: Distribución de la CMI de ofloxacino (OFL) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 148: Distribución de la CMI de nitrofurantoína (FT) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 149: Distribución de la CMI de trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) en los aislados productores de CTX-M9 12% 3% 10% 4% 71% <0,25 1 2 4 >8 40% 22% 7% 1% 30% <16 32 64 128 256 40% 60% <20 40 >320 Betalactamasas de espectro extendido 236 Tabla 72: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de los antibióticos no betalactámicos mediante el sistema VITEK 2 para los aislados productores de SHV (resultados in vitro) CMI 50 CMI 90 AN < 2 < 2 GM < 1 > 16 TM < 1 > 16 CIP > 4 > 4 NOR > 16 > 16 OFL > 8 > 8 FT 32 64 SXT < 20 > 320 Figura 150: Distribución de la CMI de amikacina (AN) en los aislados productores de SHV Figura 151: Distribución de la CMI de gentamicina (GM) en los aislados productores de SHV 5% 2% 2% 91% <2 4 8 16 71% 3% 5% 21% <1 2 4 8 >16 4. Resultados 237 Figura 152: Distribución de la CMI de tobramicina (TM) en los aislados productores de SHV Figura 153: Distribución de la CMI de ciprofloxacino (CIP) en los aislados productores de SHV Figura 154: Distribución de la CMI de norfloxacino (NOR) en los aislados productores de SHV 72% 2% 10% 16% <1 2 4 8 >16 36% 2% 2% 60% <0,25 0,5 1 2 >4 31% 58% 2% 7% 2% <0,5 1 2 4 8 >16 Betalactamasas de espectro extendido 238 Figura 155: Distribución de la CMI de ofloxacino (OFL) en los aislados productores de SHV Figura 156: Distribución de la CMI de nitrofurantoína (FT) en los aislados productores de SHV Figura 157: Distribución de la CMI de trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) en los aislados productores de SHV 31% 60% 2% 5% 2% <0,25 1 2 4 >8 43% 29% 19% 7% 2% <16 32 64 128 256 58% 2% 40% <20 40 >320 4. Resultados 239 Tabla 73: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de los antibióticos no betalactámicos mediante el sistema VITEK 2 para los aislados no productores de BLEEs (resultados in vitro) CMI 50 CMI 90 AN < 2 4 GM < 1 > 16 TM < 1 8 CIP 1 > 4 NOR 2 > 16 OFL 2 > 8 FT < 16 128 SXT < 20 > 320 Figura 158: Distribución de la CMI de amikacina (AN) en los aislados no productores de BLEEs Figura 159: Distribución de la CMI de gentamicina (GM) en los aislados no productores de BLEEs 9% 89% 1% 1% <2 4 8 16 71% 6% 5% 1% 17% <1 2 4 8 >16 Betalactamasas de espectro extendido 240 Figura 160: Distribución de la CMI de tobramicina (TM) en los aislados no productores de BLEEs Figura 161: Distribución de la CMI de ciprofloxacino (CIP) en los aislados no productores de BLEEs Figura 162: Distribución de la CMI de norfloxacino (NOR) en los aislados no productores de BLEEs 47% 1%8% 1% 43% <0,25 0,5 1 2 >4 44% 13% 5% 38% <0,5 1 2 4 8 >16 78% 5% 2% 8% 7% <1 2 4 8 >16 4. Resultados 241 Figura 163: Distribución de la CMI de ofloxacino (OFL) en los aislados no productores de BLEEs Figura 164: Distribución de la CMI de nitrofurantoína (FT) en los aislados no productores de BLEEs Figura 165: Distribución de la CMI de trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) en los aislados no productores de BLEEs 42% 5% 8% 1% 44% <0,25 1 2 4 >8 66% 13% 8% 8% 5% <16 32 64 128 256 56% 1% 43% <20 80 >320 Betalactamasas de espectro extendido 242 En las tablas 74 a 77 y figuras 166 a 169, se muestran las distribuciones de las categorías clínicas (S: sensible, I: intermedio y R: resistente) obtenidas mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos en los aislados productores de BLEEs, distinguiendo los que poseyeron una enzima CTX-M9 de los que poseyeron una SHV, y de los aislados no productores de BLEEs, después que el sistema experto AES realizara las modificaciones necesarias en las mismas una vez establecido el fenotipo de resistencia para estos antibióticos en cada aislado clínico. La cepa de referencia K. pneumoniae (ATCC 700603) se mostró en todos los ensayos in vitro intermedio a gentamicina, tobramicina y nitrofurantoína, y sensible a amikacina, ciprofloxacino, norfloxacino, ofloxacino y cotrimoxazol (Rasheed et al., 2000). E. coli ATCCC 25922 fue sensible a todos los antibióticos ensayados. 4. Resultados 243 Tabla 74: Categorías clínicas emitidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos tras la interpretación del resultado (antibióticos ensayados, no inferidos) para los aislados productores de BLEEs S I R AN 125 0 0 GM 104 3 18 TM 105 9 11 CIP 40 4 81 NOR 43 6 76 OFL 39 4 82 FT 88 26 11 SXT 62 0 63 Figura 166: Distribución de los aislados productores de BLEEs según las categorías clínicas emitidas mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos 125 104 3 18 105 9 11 40 4 81 43 6 76 39 4 82 88 26 11 62 63 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AN GM TM CIP NOR OFL FT SXT S I R Betalactamasas de espectro extendido 244 Tabla 75: Categorías clínicas emitidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos tras la interpretación del resultado (antibióticos ensayados, no inferidos) para los aislados productores de CTX-M9 S I R AN 67 0 0 GM 61 0 6 TM 62 3 2 CIP 18 3 46 NOR 20 5 42 OFL 17 3 47 FT 46 15 6 SXT 27 0 40 Figura 167: Distribución de los aislados productores de CTX-M9 según las categorías clínicas emitidas mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos 67 61 6 62 3 2 18 3 46 20 5 42 17 3 47 46 15 6 27 40 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AN GM TM CIP NOR OFL FT SXT S I R 4. Resultados 245 Tabla 76: Categorías clínicas emitidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos tras la interpretación del resultado (antibióticos ensayados, no inferidos) para los aislados productores de SHV S I R AN 58 0 0 GM 43 3 12 TM 43 6 9 CIP 22 1 35 NOR 23 1 34 OFL 22 1 35 FT 42 11 5 SXT 35 0 23 Figura 168: Distribución de los aislados productores de SHV según las categorías clínicas emitidas mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos 58 43 3 12 43 6 9 22 1 35 23 1 34 22 1 35 42 11 5 35 23 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AN GM TM CIP NOR OFL FT SXT S I R Betalactamasas de espectro extendido 246 Tabla 77: Categorías clínicas emitidas por el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos tras la interpretación del resultado (antibióticos ensayados, no inferidos) para los aislados no productores de BLEEs S I R AN 344 0 0 GM 280 4 60 TM 292 28 24 CIP 192 4 148 NOR 196 16 132 OFL 184 8 152 FT 272 28 44 SXT 192 0 152 Figura 169: Distribución de los aislados no productores de BLEEs según las categorías clínicas emitidas mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos 344 280 4 60 292 28 24 192 4 148 196 16 132 184 8 152 272 28 44 192 152 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AN GM TM CIP NOR OFL FT SXT S I R 4. Resultados 247 4.9. Resultados obtenidos mediante WIDER para los antibióticos betalactámicos estudiados En la tabla 78 aparecen los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos en los 125 aislados clínicos productores de BLEEs según los valores obtenidos in vitro. La distribución de los resultados de CMI para cada antibiótico betalactámico, en porcentaje respecto al total de este grupo, quedan reflejados en las figuras 170 a 180. En la tabla 79 se muestran los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos en los 67 aislados clínicos productores de CTX-M9 según los valores obtenidos in vitro. La distribución de los resultados de CMI para cada antibiótico betalactámico, en porcentaje respecto al total de este grupo, quedan reflejados en las figuras 181 a 191. En la tabla 80 mostramos los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos en los 58 aislados clínicos productores de SHV según los valores obtenidos in vitro. La distribución de los resultados de CMI para cada antibiótico betalactámico, en porcentaje respecto al total de este grupo, quedan reflejados en las figuras 192 a 202. En la tabla 81 se recogen los resultados de CMI 50 y CMI 90 obtenidos mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos en los 344 aislados clínicos no productores de BLEEs según los valores obtenidos in vitro. La distribución de los resultados de CMI para cada antibiótico betalactámico, en porcentaje respecto al total de este grupo, quedan reflejados en las figuras 203 a 213. Betalactamasas de espectro extendido 248 Tabla 78: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de antibióticos betalactámicos mediante el sistema WIDER para los aislados productores de BLEEs CMI 50 CMI 90 AMX > 16 > 16 A/C 8/4 > 16/8 P/T < 16/4 > 64/4 CF > 8 > 8 CFX > 16 > 16 CX 16 > 16 CTX > 8 > 8 TAZ 16 > 16 TZ/C < 1/4 8/4 CFP > 16 > 16 MER < 1 < 1 Figura 170: Distribución de la CMI de amoxicilina (AMX) en los aislados productores de BLEEs 1% 99% <4 8 >16 4. Resultados 249 Figura 171: Distribución de la CMI de amoxicilina-ácido clavulánico (A/C) en los aislados productores de BLEEs Figura 172: Distribución de la CMI de piperacilina-tazobactam (P/T) en los aislados productores de BLEEs Figura 173: Distribución de la CMI de cefalotina (CF) en los aislados productores de BLEEs 29% 41% 20% 10% <4/2 8/4 16/8 >16/8 67% 2% 6% 25% <16/4 32/4 64/4 >64/4 >8 Betalactamasas de espectro extendido 250 Figura 174: Distribución de la CMI de cefuroxima (CFX) en los aislados productores de BLEEs Figura 175: Distribución de la CMI de cefoxitina (CX) en los aislados productores de BLEEs Figura 176: Distribución de la CMI de cefotaxima (CTX) en los aislados productores de BLEEs 94% 1% 4% 1% <4 4 8 16 >16 49% 1% 15% 35% <8 8 16 >16 2%1% 97% <1 1 2 4 8 >8 4. Resultados 251 Figura 177: Distribución de la CMI de ceftazidima (TAZ) en los aislados productores de BLEEs Figura 178: Distribución de la CMI de ceftazidima-ácido clavulánico (TZ/C) en los aislados productores de BLEEs Figura 179: Distribución de la CMI de cefepime (CFP) en los aislados productores de BLEEs 16% 2% 14% 3% 9% 6% 50% <1 1 2 4 8 16 >16 2% 88% 10% <1/4 1/4 8/4 >8/4 4% 80% 4% 4% 5% 3% <1 1 2 4 8 16 >16 Betalactamasas de espectro extendido 252 Figura 180: Distribución de la CMI de meropenem (MER) en los aislados productores de BLEEs Tabla 79: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de antibióticos betalactámicos mediante el sistema WIDER para los aislados productores de CTX-M9 CMI 50 CMI 90 AMX > 16 > 16 A/C 8/4 > 16/8 P/T < 16/4 > 64/4 CF > 8 > 8 CFX > 16 > 16 CX 16 > 16 CTX > 8 > 8 TAZ 8 > 16 TZ/C < 1/4 8/4 CFP > 16 > 16 MER < 1 < 1 3% 96% 1% <1 1 2 4 8 >8 4. Resultados 253 Figura 181: Distribución de la CMI de amoxicilina (AMX) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 182: Distribución de la CMI de amoxicilina-ácido clavulánico (A/C) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 183: Distribución de la CMI de piperacilina-tazobactam (P/T) en los aislados productores de CTX-M9 1% 99% <4 8 >16 31% 16% 13% 40% <4/2 8/4 16/8 >16/8 64% 3% 9% 24% <16/4 32/4 64/4 >64/4 Betalactamasas de espectro extendido 254 Figura 184: Distribución de la CMI de cefalotina (CF) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 185: Distribución de la CMI de cefuroxima (CFX) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 186: Distribución de la CMI de cefoxitina (CX) en los aislados productores de CTX-M9 >8 40% 1% 43% 16% <8 8 16 >16 1% 99% <4 4 8 16 >16 4. Resultados 255 Figura 187: Distribución de la CMI de cefotaxima (CTX) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 188: Distribución de la CMI de ceftazidima (TAZ) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 189: Distribución de la CMI de ceftazidima-ácido clavulánico (TZ/C) en los aislados productores de CTX-M9 22% 3% 21% 1%13% 9% 31% <1 1 2 4 8 16 >16 13% 1% 86% <1/4 1/4 8/4 >8/4 100% >8 Betalactamasas de espectro extendido 256 Figura 190: Distribución de la CMI de cefepime (CFP) en los aislados productores de CTX-M9 Figura 191: Distribución de la CMI de meropenem (MER) en los aislados productores de CTX-M9 3% 3% 92% 1% 1% <1 1 2 4 8 16 >16 4% 96% <1 1 2 4 8 >8 4. Resultados 257 Tabla 80: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de antibióticos betalactámicos mediante el sistema WIDER para los aislados productores de SHV CMI 50 CMI 90 AMX > 16 > 16 A/C 8/4 16/8 P/T < 16/4 > 64/4 CF > 8 > 8 CFX > 16 > 16 CX < 8 > 16 CTX > 8 > 8 TAZ > 16 > 16 TZ/C < 1/4 8/4 CFP > 16 > 16 MER < 1 < 1 Figura 192: Distribución de la CMI de amoxicilina (AMX) en los aislados productores de SHV >16 Betalactamasas de espectro extendido 258 Figura 193: Distribución de la CMI de amoxicilina-ácido clavulánico (A/C) en los aislados productores de SHV Figura 194: Distribución de la CMI de piperacilina-tazobactam (P/T) en los aislados productores de SHV Figura 195: Distribución de la CMI de cefalotina (CF) en los aislados productores de SHV 26% 24% 7% 43% <4/2 8/4 16/8 >16/8 70% 2% 2% 26% <16/4 32/4 64/4 >64/4 >8 4. Resultados 259 Figura 196: Distribución de la CMI de cefuroxima (CFX) en los aislados productores de SHV Figura 197: Distribución de la CMI de cefoxitina (CX) en los aislados productores de SHV Figura 198: Distribución de la CMI de cefotaxima (CTX) en los aislados productores de SHV 9% 89% 2% <4 4 8 16 >16 58% 14% 28% <8 8 16 >16 95% 2% 3% <1 1 2 4 8 >8 Betalactamasas de espectro extendido 260 Figura 199: Distribución de la CMI de ceftazidima (TAZ) en los aislados productores de SHV Figura 200: Distribución de la CMI de ceftazidima-ácido clavulánico (TZ/C) en los aislados productores de SHV Figura 201: Distribución de la CMI de cefepime (CFP) en los aislados productores de SHV 9% 7% 5% 3% 3% 73% <1 1 2 4 8 16 >16 7% 3% 90% <1/4 1/4 8/4 >8/4 9% 5% 5% 67% 7% 7% <1 1 2 4 8 16 >16 4. Resultados 261 Figura 202: Distribución de la CMI de meropenem (MER) en los aislados productores de SHV Tabla 81: CMI 50 y CMI 90 (en µg/ml) de antibióticos betalactámicos mediante el sistema WIDER para los aislados no productores de BLEEs CMI 50 CMI 90 AMX > 16 > 16 A/C 16/8 > 16/8 P/T < 16/4 > 64/4 CF > 8 > 8 CFX 8 > 16 CX > 16 > 16 CTX 2 > 8 TAZ 4 > 16 TZ/C < 1/4 8/4 CFP 1 16 MER < 1 1 2% 96% 2% <1 1 2 4 8 >8 Betalactamasas de espectro extendido 262 Figura 203: Distribución de la CMI de amoxicilina (AMX) en los aislados no productores de BLEEs Figura 204: Distribución de la CMI de amoxicilina-ácido clavulánico (A/C) en los aislados no productores de BLEEs Figura 205: Distribución de la CMI de piperacilina-tazobactam (P/T) en los aislados no productores de BLEEs 13% 5% 82% <4 8 >16 19% 22% 29% 30% <4/2 8/4 16/8 >16/8 65% 2% 12% 21% <16/4 32/4 64/4 >64/4 4. Resultados 263 Figura 206: Distribución de la CMI de cefalotina (CF) en los aislados no productores de BLEEs Figura 207: Distribución de la CMI de cefuroxima (CFX) en los aislados no productores de BLEEs Figura 208: Distribución de la CMI de cefoxitina (CX) en los aislados no productores de BLEEs 21% 7% 72% <8 8 >8 22% 20% 13% 26% 19% <4 4 8 16 >16 13% 7% 24% 56% <8 8 16 >16 Betalactamasas de espectro extendido 264 Figura 209: Distribución de la CMI de cefotaxima (CTX) en los aislados no productores de BLEEs Figura 210: Distribución de la CMI de ceftazidima (TAZ) en los aislados no productores de BLEEs Figura 211: Distribución de la CMI de ceftazidima-ácido clavulánico (TZ/C) en los aislados no productores de BLEEs 36% 14%15% 15% 8% 12% <1 1 2 4 8 >8 23% 3% 20% 21% 9% 10% 14% <1 1 2 4 8 16 >16 8% 85% 7% <1/4 1/4 8/4 >8/4 4. Resultados 265 Figura 212: Distribución de la CMI de cefepime (CFP) en los aislados no productores de BLEEs Figura 213: Distribución de la CMI de meropenem (MER) en los aislados no productores de BLEEs 44% 15% 15% 5% 5% 6% 10% <1 1 2 4 8 16 >16 90% 8% 2% <1 1 2 4 8 >8 Betalactamasas de espectro extendido 266 En las tablas 82, 84, 86 y 88 y figuras 214, 216, 218 y 220, se muestran las distribuciones de las categorías clínicas (S: sensible, I: intermedio y R: resistente) obtenidas mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos en los aislados productores de BLEEs, distinguiendo los que poseyeron una enzima CTX-M9 de los que poseyeron una SHV, y de los aislados no productores de BLEEs, antes que el sistema realizara las modificaciones necesarias en las mismas una vez establecido el fenotipo de resistencia para estos antibióticos (BLEE o no BLEE) en cada aislado clínico. En las tablas 83, 85, 87 y 89 y figuras 215, 217, 219 y 221, se muestran las distribuciones de las categorías clínicas (S: sensible, I: intermedio y R: resistente) emitidas por el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos en los aislados productores de BLEEs, distinguiendo los que poseyeron una enzima CTX-M9 de los que poseyeron una SHV, y de los aislados no productores de BLEEs, después que el sistema realizó las modificaciones necesarias en las mismas una vez establecido el fenotipo de resistencia para estos antibióticos (BLEE o no BLEE) en cada aislado clínico. Como puede observarse, los antibióticos betalactámicos ensayados por el sistema WIDER que fueron modificados tras la interpretación del fenotipo obtenido en los aislados productores de BLEEs fueron cefuroxima, cefotaxima, ceftazidima y cefepime. En todos los casos el sistema modificó aquellos aislados con categoría clínica sensible e informó estos antibióticos como resistentes limitando su uso clínico. 4. Resultados 267 Tabla 82: Categorías clínicas obtenidas por el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos antes de la interpretación del resultado fenotípico en los aislados productores de BLEEs S I R AMX 1 0 124 A/C 87 25 13 P/T 84 10 31 CF 0 0 125 CFX 1 6 118 CX 62 19 44 CTX 3 0 122 TAZ 55 8 62 CFP 21 4 100 MER 124 0 1 Figura 214: Distribución de los aislados productores de BLEEs según las categorías clínicas obtenidas in vitro mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos 1 124 87 25 13 84 10 31 125 1 6 118 62 19 44 3 122 55 8 62 21 4 100 124 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMX A/C P/T CF CFX CX CTX TAZ CFP MER S I R Betalactamasas de espectro extendido 268 Tabla 83: Categorías clínicas emitidas por el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos tras la interpretación del resultado fenotípico en los aislados productores de BLEEs S I R AMX 1 0 124 A/C 87 25 13 P/T 84 10 31 CF 0 0 125 CFX 1 1 123 CX 62 19 44 CTX 0 0 125 TAZ 23 0 102 CFP 7 0 118 MER 124 0 1 Figura 215: Distribución de los aislados productores de BLEEs según las categorías clínicas emitidas mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos 1 124 87 25 13 84 10 31 125 1 1 123 62 19 44 125 23 102 7 118 124 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMX A/C P/T CF CFX CX CTX TAZ CFP MER S I R 4. Resultados 269 Tabla 84: Categorías clínicas obtenidas por el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos antes de la interpretación del resultado fenotípico en los aislados productores de CTX-M9 S I R AMX 1 0 66 A/C 47 11 9 P/T 43 8 16 CF 0 0 67 CFX 1 0 66 CX 28 11 28 CTX 0 0 67 TAZ 41 6 20 CFP 5 1 61 MER 67 0 0 Figura 216: Distribución de los aislados productores de CTX-M9 según las categorías clínicas obtenidas in vitro mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos 1 66 47 11 9 43 8 16 67 1 66 28 11 28 67 41 6 20 5 1 61 67 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMX A/C P/T CF CFX CX CTX TAZ CFP MER S I R Betalactamasas de espectro extendido 270 Tabla 85: Categorías clínicas emitidas por el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos tras la interpretación del resultado fenotípico en los aislados productores de CTX-M9 S I R AMX 1 0 66 A/C 47 11 9 P/T 43 8 16 CF 0 0 67 CFX 1 0 66 CX 28 11 28 CTX 0 0 67 TAZ 18 0 49 CFP 3 0 64 MER 67 0 0 Figura 217: Distribución de los aislados productores de CTX-M9 según las categorías clínicas emitidas mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos 1 66 47 11 9 43 8 16 67 1 66 28 11 28 67 18 49 3 64 67 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMX A/C P/T CF CFX CX CTX TAZ CFP MER S I R 4. Resultados 271 Tabla 86: Categorías clínicas obtenidas por el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos antes de la interpretación del resultado fenotípico en los aislados productores de SHV S I R AMX 0 0 58 A/C 40 14 4 P/T 41 2 15 CF 0 0 58 CFX 0 6 52 CX 34 8 16 CTX 3 0 55 TAZ 14 2 42 CFP 16 3 39 MER 57 0 1 Figura 218: Distribución de los aislados productores de SHV según las categorías clínicas obtenidas in vitro mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos 58 40 14 4 41 2 15 58 6 52 34 8 16 3 55 14 2 42 16 3 39 57 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMX A/C P/T CF CFX CX CTX TAZ CFP MER S I R Betalactamasas de espectro extendido 272 Tabla 87: Categorías clínicas emitidas por el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos tras la interpretación del resultado fenotípico en los aislados productores de SHV S I R AMX 0 0 58 A/C 40 14 4 P/T 41 2 15 CF 0 0 58 CFX 0 2 56 CX 34 8 16 CTX 0 0 58 TAZ 5 0 53 CFP 4 0 54 MER 57 0 1 Figura 219: Distribución de los aislados productores de SHV según las categorías clínicas emitidas mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos 58 40 14 4 41 2 15 58 2 56 34 8 16 58 5 53 4 54 57 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMX A/C P/T CF CFX CX CTX TAZ CFP MER S I R 4. Resultados 273 Tabla 88: Categorías clínicas obtenidas por el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos antes de la interpretación del resultado fenotípico en los aislados no productores de BLEEs S I R AMX 60 0 284 A/C 140 100 104 P/T 224 48 72 CF 96 0 248 CFX 144 136 64 CX 68 84 192 CTX 304 0 40 TAZ 276 32 36 CFP 308 16 20 MER 336 0 8 Figura 220: Distribución de los aislados no productores de BLEEs según las categorías clínicas obtenidas in vitro mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos 60 284 140 100 104 224 48 72 96 248 144 136 64 68 84 192 304 40 276 32 36 308 16 20 336 8 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMX A/C P/T CF CFX CX CTX TAZ CFP MER S I R Betalactamasas de espectro extendido 274 Tabla 89: Categorías clínicas emitidas por el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos tras la interpretación del resultado en los aislados no productores de BLEEs S I R AMX 60 0 284 A/C 140 100 104 P/T 224 48 72 CF 92 0 252 CFX 120 116 108 CX 68 84 192 CTX 268 0 76 TAZ 260 28 56 CFP 280 8 56 MER 336 0 8 Figura 221: Distribución de los aislados no productores de BLEEs según las categorías clínicas emitidas mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos 60 284 140 100 104 224 48 72 92 252 120 116 108 68 84 192 268 76 260 28 56 280 8 56 336 8 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMX A/C P/T CF CFX CX CTX TAZ CFP MER S I R 4. Resultados 275 La cepa de referencia K. pneumoniae (ATCC 700603) se mostró en todos los ensayos in vitro resistente a ampicilina, cefoxitina y ceftazidima, y sensible a amoxicilina-ácido clavulánico, piperacilina- tazobactam, cefotaxima, cefepime y carbapenémicos (Rasheed et al., 2000). E. coli ATCC 25922 fue sensible a todos los antibióticos ensayados. 4.10. Evaluación de los diferentes métodos fenotípicos estudiados para la detección de BLEEs En función de los resultados obtenidos podemos evaluar la capacidad de los distintos métodos de detección fenotípica de BLEEs (método B, E-test TZ/TZL, E-test CT/CTL, VITEK 2 y WIDER) en relación al método fenotípico que hemos considerado de referencia, el método A. Para ello valoramos sólo los resultados obtenidos en los aislados de una única especie, E. coli, por los distintos procedimientos, ya que encontramos un número de muestra lo suficientemente amplia en esta especie para realizar dicha valoración, no así en las otras dos especies evaluadas en este estudio. Así, en la tabla 90 mostramos, en números absolutos, los aislados clínicos que según cada método fenotípico poseen o no una BLEE en comparación con los resultados obtenidos por el método fenotípico de referencia. En la tabla 91 se reflejan los valores de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo (con sus respectivos intervalos de confianza al 95% obtenidos mediante la prueba de Clopper-Pearson para una proporción) de cada método fenotípico valorado para la detección de BLEEs en nuestros aislados de Betalactamasas de espectro extendido 276 la especie E. coli, en relación al método fenotípico de referencia, el método A. Tabla 90: Distribución de resultados obtenidos en la determinación de la presencia de BLEEs en E. coli por los métodos fenotípicos utilizados Método fenotípico BLEE Positivo BLEE Negativo Total Positivo 115 12 127 VITEK 2 Negativo 0 272 272 Positivo 95 44 139 WIDER Negativo 20 240 260 Positivo 57 0 57 TZ/TZL Negativo 58 284 342 Positivo 115 0 115 CT/CTL Negativo 0 284 284 Positivo 115 0 115 TZ/TZL y CT/CTL* Negativo 0 284 284 Positivo 115 0 115 MÉTODO B Negativo 0 284 284 TZ/TZL: E-test de ceftazidima y ceftazidima más ácido clavulánico, CT/CTL: E-test de cefotaxima y cefotaxima más ácido clavulánico. *Valoración de los dos E-test cuando se usan conjuntamente 4. Resultados 277 Tabla 91: Resultados de sensibilidad, especificidad y valores predictivos (intervalos de confianza al 95%) para los métodos fenotípicos utilizados, considerando como referencia el método A Método Sensibilidad Especificidad VPP VPN VITEK2 100% (97-100%) 95,8% (92,7-97,8%) 90,6% (84-95%) 100% (98,6-100%) WIDER 82,6% (74,6-89%) 84,5% (79,7-88,5%) 68,3% (59,9-76%) 92,3% (88,4-95,3%) TZ/TZL 49,6% (39,2-58,2%) 100% (98,8-100%) 100% (93,7-100%) 83% (78,6-86,9%) CT/CTL 100% (97-100%) 100% (98,8-100%) 100% (96,8-100%) 100% (98,7-100%) TZ/TZL y CT/CTL 100% (97-100%) 100% (98,8-100%) 100% (96,8-100%) 100% (98,7-100%) MÉTODO B 100% (97-100%) 100% (98,8-100%) 100% (96,8-100%) 100% (98,7-100%) TZ/TZL: E-test de ceftazidima y ceftazidima más ácido clavulánico, CT/CTL: E-test de cefotaxima y cefotaxima más ácido clavulánico. VPP: Valor predictivo positivo, VPN: Valor predictivo negativo. Betalactamasas de espectro extendido 278 En la tabla 92 mostramos los 16 resultados falsos positivos por el sistema VITEK 2 (12 E. coli y 4 K. oxytoca), comparando los resultados obtenidos por el método de referencia (que determina que estos aislados no son productores de BLEEs) y las CMIs de cefotaxima, cefpodoxima y ceftazidima según el sistema VITEK 2. En estos 16 casos el sistema experto AES determinó que los aislados poseían una BLEE. En la tabla 93 aparecen los 56 resultados falsos positivos por el sistema WIDER (44 E. coli, 8 K. pneumoniae y 4 K. oxytoca), comparando los resultados obtenidos por el método de referencia (que determina que estos aislados no son productores de BLEEs) y las CMIs de cefotaxima, ceftazidima y ceftazidima-ácido clavulánico según el sistema WIDER. En estos 56 casos el sistema determinó que los aislados poseían una BLEE. Se puede observar que los aislados 3, 40, 160, 225, 263, 264, 322 y 391 fueron considerados como positivos por los dos sistemas automatizados. En la tabla 94 se reflejan los 23 resultados falsos negativos por el sistema WIDER (20 E. coli, 2 K. pneumoniae y 1 K. oxytoca), comparando los resultados obtenidos por el método de referencia (que determina que estos aislados son productores de BLEEs) y las CMIs de cefotaxima, ceftazidima y ceftazidima-ácido clavulánico según el sistema WIDER. En estos 23 casos el sistema determinó que los aislados no poseían una BLEE. En la tabla 95 se recogen los 62 resultados falsos negativos por el E-test de ceftazidima (59 E. coli y 3 K. pneumoniae), comparando los resultados obtenidos por el método de referencia (que determina que estos aislados son productores de BLEEs) y las CMIs de TZ y TZL. En estos 61 casos los cocientes (TZ/TZL) fueron inferiores a 8 o indeterminados (ND). 4. Resultados 279 Tabla 92: Comparación de los resultados obtenidos por el método A (diámetro en mm) y el sistema VITEK 2 (CMIs en µg/ml) para los 16 aislados falsos positivos por éste último. VITEK 2 Aislado Especie CAZ CD 02 CTX CD 03 CPD CD 01 CTX CPD CAZ 3 K. oxytoca 32 32 29 30 28 29 < 1 < 0,25 < 1 40 E. coli 27 26 29 30 24 27 < 1 2 < 1 - > 2 64 E. coli 23 26 27 27 6 6 < 1 > 8 2 116 E. coli 23 25 27 28 6 6 < 1 > 8 2 147 E. coli 24 24 28 28 6 6 < 1 > 8 2 157 E. coli 23 23 26 26 6 6 < 1 > 8 2 160 K. oxytoca 25 27 28 30 22 22 < 1 < 0,25 < 1 205 E. coli 27 28 30 30 6 6 < 1 > 8 2 225 E. coli 30 34 30 30 23 27 < 1 2 < 1 - > 2 263 K. oxytoca 30 30 32 34 30 30 < 1 < 0,25 < 1 264 E. coli 28 30 30 30 23 27 < 1 2 < 1 - > 2 304 E. coli 28 30 31 30 6 6 < 1 > 8 2 322 E. coli 23 24 30 30 21 21 < 1 2 < 1 - > 2 353 E. coli 25 25 26 26 6 6 < 1 > 8 2 372 E. coli 26 25 28 26 6 6 < 1 > 8 2 391 K. oxytoca 26 30 29 34 25 25 < 1 < 0,25 < 1 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CD02: Ceftazidima más ácido clavulánico (30/10 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CD03: Cefotaxima más ácido clavulánico (30/10 µg), CPD : Cefpodoxima (10 µg), CD01: Cefpodoxima más ácido clavulánico (10/1 µg) Betalactamasas de espectro extendido 280 Tabla 93: Comparación de los resultados obtenidos por el método A (diámetro en mm) y el sistema WIDER (CMIs en µg/ml) para los 56 aislados falsos positivos por éste último. WIDER Aislado Especie CAZ CD 02 CTX CD 03 CPD CD 01 CTX TAZ TZ/C 3 K. oxytoca 32 32 29 30 28 29 <1 >16 <1/4 6 K. pneumoniae 27 27 30 30 24 25 >8 <1 <1/4 14 E. coli 27 27 30 30 25 25 <1 <1 <1/4 20 E. coli 32 32 36 36 25 25 <1 16 <1/4 23 E. coli 32 32 36 36 25 25 <1 16 <1/4 29 E. coli 26 30 28 30 23 23 <1 >16 <1/4 33 K. pneumoniae 27 27 30 30 24 25 >8 <1 <1/4 35 E. coli 30 32 34 34 27 27 <1 16 <1/4 40 E. coli 27 26 29 30 24 27 >8 <1 <1/4 45 K. pneumoniae 29 31 36 38 30 30 >8 <1 <1/4 53 E. coli 27 27 30 30 25 25 <1 <1 <1/4 59 E. coli 26 26 30 30 22 22 <1 16 <1/4 108 E. coli 26 28 30 32 27 29 4 16 <1/4 131 E. coli 26 28 30 32 27 29 4 16 <1/4 142 E. coli 32 32 36 36 25 25 <1 16 <1/4 144 E. coli 26 30 28 30 23 23 <1 >16 <1/4 152 E. coli 26 28 30 32 27 29 4 16 <1/4 155 E. coli 26 26 30 30 22 22 <1 16 <1/4 160 K. oxytoca 25 27 28 30 22 22 <1 >16 <1/4 173 K. pneumoniae 27 27 30 30 24 25 >8 <1 <1/4 176 E. coli 25 25 28 28 24 24 <1 16 <1/4 188 E. coli 30 30 30 30 22 24 >8 >16 <1/4 212 E. coli 30 32 34 34 27 27 <1 16 <1/4 222 E. coli 26 27 30 30 23 24 <1 >16 <1/4 225 E. coli 30 34 30 30 23 27 >8 <1 <1/4 234 E. coli 30 32 34 34 27 27 <1 16 <1/4 238 E. coli 26 26 28 28 23 23 <1 >16 <1/4 241 E. coli 26 30 28 30 23 23 <1 >16 <1/4 251 E. coli 25 25 28 28 24 24 <1 16 <1/4 259 E. coli 26 26 30 30 22 22 <1 16 <1/4 262 E. coli 26 27 30 30 23 24 <1 >16 <1/4 263 K. oxytoca 30 30 32 34 30 30 <1 >16 <1/4 264 E. coli 28 30 30 30 23 27 >8 <1 <1/4 271 E. coli 30 30 30 30 22 24 >8 >16 <1/4 286 K. pneumoniae 29 31 36 38 30 30 >8 <1 <1/4 287 E. coli 26 26 28 28 23 23 <1 >16 <1/4 289 E. coli 27 27 30 30 25 25 <1 <1 <1/4 291 E. coli 32 32 36 36 25 25 <1 16 <1/4 307 K. pneumoniae 29 31 36 38 30 30 >8 <1 <1/4 4. Resultados 281 WIDER Aislado Especie CAZ CD 02 CTX CD 03 CPD CD 01 CTX TAZ TZ/C 315 E. coli 26 30 28 30 23 23 <1 >16 <1/4 319 K. pneumoniae 27 27 30 30 24 25 >8 <1 <1/4 322 E. coli 23 24 30 30 21 21 >8 <1 <1/4 326 K. pneumoniae 29 31 36 38 30 30 >8 <1 <1/4 334 E. coli 25 25 28 28 24 24 <1 16 <1/4 338 E. coli 26 26 28 28 23 23 <1 >16 <1/4 342 E. coli 26 28 30 32 27 29 4 16 <1/4 359 E. coli 25 25 28 28 24 24 <1 16 <1/4 362 E. coli 26 26 30 30 22 22 <1 16 <1/4 367 E. coli 30 32 34 34 27 27 <1 16 <1/4 370 E. coli 27 27 30 30 25 25 <1 <1 <1/4 378 E. coli 26 27 30 30 23 24 <1 >16 <1/4 383 E. coli 30 30 30 30 22 24 >8 >16 <1/4 385 E. coli 26 26 28 28 23 23 <1 >16 <1/4 391 K. oxytoca 26 30 29 34 25 25 <1 >16 <1/4 394 E. coli 26 27 30 30 23 24 <1 >16 <1/4 397 E. coli 30 30 30 30 22 24 >8 >16 <1/4 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CD02: Ceftazidima más ácido clavulánico (30/10 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CD03: Cefotaxima más ácido clavulánico (30/10 µg), CPD : Cefpodoxima (10 µg), CD01: Cefpodoxima más ácido clavulánico (10/1 µg) Betalactamasas de espectro extendido 282 Tabla 94: Comparación de los resultados obtenidos por el método A (diámetro en mm) y el sistema WIDER (CMIs en µg/ml) para los 23 aislados falsos negativos por éste último. WIDER Aislado Especie Tipo de BLEE CAZ CD 02 CTX CD 03 CPD CD 01 CTX TAZ TZ/C 19 K. pneumoniae SHV 18 28 17 32 6 22 >8 4 <1/4 42 E. coli CTX-M9 19 28 16 26 6 20 >8 2 <1/4 51 E. coli CTX-M9 28 30 20 30 6 21 >8 2 <1/4 54 E. coli SHV 18 32 14 32 6 22 >8 8 <1/4 56 E. coli CTX-M9 30 30 20 32 6 22 >8 1 <1/4 58 E. coli CTX-M9 28 30 22 28 6 22 >8 <1 <1/4 62 E. coli SHV 26 32 20 32 12 26 >8 <1 <1/4 63 E. coli CTX-M9 28 30 16 28 6 20 >8 8 <1/4 112 E. coli CTX-M9 26 34 10 34 6 24 >8 8 <1/4 122 E. coli CTX-M9 27 30 19 32 6 23 >8 2 <1/4 138 E. coli CTX-M9 21 30 12 30 6 22 >8 2 <1/4 139 E. coli CTX-M9 26 29 16 29 6 18 >8 2 <1/4 140 E. coli CTX-M9 30 30 20 34 12 26 >8 <1 <1/4 141 E. coli CTX-M9 26 32 14 32 10 24 >8 8 <1/4 165 E. coli CTX-M9 24 25 16 25 6 16 >8 8 <1/4 191 E. coli CTX-M9 23 26 12 24 6 21 >8 2 <1/4 204 E. coli CTX-M9 21 32 14 32 6 22 >8 8 8/4 215 K. oxytoca SHV 18 30 19 32 6 23 >8 <1 <1/4 223 K. pneumoniae SHV 20 30 19 36 6 26 >8 <1 <1/4 237 E. coli CTX-M9 28 30 20 30 6 21 >8 <1 8/4 246 E. coli CTX-M9 29 30 22 30 6 20 >8 8 <1/4 260 E. coli CTX-M9 20 35 12 35 6 24 >8 8 8/4 274 E. coli CTX-M9 26 29 14 30 6 21 >8 8 8/4 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CD02: Ceftazidima más ácido clavulánico (30/10 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CD03: Cefotaxima más ácido clavulánico (30/10 µg), CPD : Cefpodoxima (10 µg), CD01: Cefpodoxima más ácido clavulánico (10/1 µg) 4. Resultados 283 Tabla 95: Comparación de los resultados obtenidos por el método A (diámetro en mm) y el E-test de ceftazidima (CMIs en µg/ml) para los 61 aislados falsos negativos por éste último. E-test TZ/TZL Aislado Especie Tipo de BLEE CAZ CD 02 CTX CD 03 CPD CD 01 TZ TZL RATIO TZ/TZL 1 E. coli CTX-M9 32 36 10 24 6 20 1 0,38 2,6 25 E. coli CTX-M9 21 30 14 30 6 17 <0,50 0,064 <7,8 26 E. coli CTX-M9 27 30 17 28 6 18 0,5 0,094 5,3 27 E. coli CTX-M9 26 30 19 30 6 20 <0,50 <0,064 ND 31 K. pneumoniae SHV 20 30 24 34 12 30 1,5 0,19 7,9 42 E. coli CTX-M9 19 28 16 26 6 20 <0,50 0,125 <4 58 E. coli CTX-M9 28 30 22 28 6 22 <0,50 <0,064 ND 62 E. coli SHV 26 32 20 32 12 26 <0,5 0,064 <7,8 65 E. coli CTX-M9 24 28 18 28 6 20 1,5 0,38 3,9 115 E. coli CTX-M9 26 30 15 30 6 22 <0,50 0,094 <5,3 122 E. coli CTX-M9 27 30 19 32 6 23 0,75 0,125 6 124 E. coli CTX-M9 26 32 19 32 6 23 0,75 0,094 7,9 132 E. coli CTX-M9 25 30 12 32 6 21 <0,50 0,064 <7,8 136 E. coli CTX-M9 24 30 16 34 6 24 <0,50 0,064 <7,8 137 E. coli CTX-M9 26 32 18 32 6 23 0,75 0,125 6 138 E. coli CTX-M9 21 30 12 30 6 22 0,75 0,125 6 139 E. coli CTX-M9 26 29 16 29 6 18 0,75 0,19 3,9 140 E. coli CTX-M9 30 30 20 34 12 26 <0,50 0,094 <5,3 141 E. coli CTX-M9 26 32 14 32 10 24 <<10 0,094 <5,3 145 E. coli CTX-M9 22 31 14 31 6 21 <0,50 0,125 <4 149 E. coli CTX-M9 26 30 14 29 6 19 0,5 0,094 5,3 151 E. coli CTX-M9 24 30 16 30 6 20 0,75 0,19 3,9 153 E. coli CTX-M9 24 32 14 32 6 18 0,75 0,25 3 159 E. coli CTX-M9 28 30 16 30 6 16 0,75 0,19 3,9 161 E. coli CTX-M9 26 30 17 30 6 20 0,75 0,19 3,9 163 E. coli CTX-M9 22 32 12 32 6 22 1 0,25 4 165 E. coli CTX-M9 24 25 16 25 6 16 0,5 0,19 2,6 169 E. coli CTX-M9 23 36 15 36 6 16 0,75 0,25 3 171 E. coli CTX-M9 22 30 17 27 6 18 0,75 0,19 3,9 178 E. coli SHV 20 30 16 34 12 24 0,75 0,19 3,9 185 E. coli CTX-M9 30 34 14 34 6 23 <0,50 <0,064 ND 186 E. coli CTX-M9 32 34 12 32 6 23 <0,50 <0,064 ND 187 E. coli CTX-M9 30 34 18 34 6 25 <0,50 <0,064 ND 191 E. coli CTX-M9 23 26 12 24 6 21 0,75 0,094 7,9 192 E. coli CTX-M9 24 34 20 30 6 22 0,5 0,125 4 193 E. coli CTX-M9 28 36 20 30 10 26 0,5 0,064 7,8 197 K. pneumoniae SHV 22 34 22 34 17 30 0,5 0,064 7,8 200 E. coli CTX-M9 20 26 14 25 6 15 1 0,19 5,3 204 E. coli CTX-M9 21 32 14 32 6 22 0,75 0,19 3,9 207 E. coli CTX-M9 26 30 18 32 6 24 0,75 0,125 6 210 E. coli CTX-M9 24 26 18 28 6 19 0,5 0,064 7,8 Betalactamasas de espectro extendido 284 E-test TZ/TZL Aislado Especie Tipo de BLEE CAZ CD 02 CTX CD 03 CPD CD 01 TZ TZL RATIO TZ/TZL 211 E. coli CTX-M9 26 32 14 32 6 22 <0,50 0,094 <5,3 221 E. coli CTX-M9 24 27 18 27 6 20 <0,50 0,19 <2,6 223 K. pneumoniae SHV 20 30 19 36 6 26 0,75 0,125 <5,3 230 E. coli CTX-M9 12 25 17 27 6 18 0,5 0,064 7,8 232 E. coli CTX-M9 25 34 18 35 6 18 0,75 0,19 2,6 233 E. coli CTX-M9 22 32 14 32 6 23 1 0,19 5,3 235 E. coli CTX-M9 24 30 14 28 6 17 0,75 0,19 3,9 240 E. coli CTX-M9 30 32 18 32 6 21 <0,50 0,064 <7,8 245 E. coli CTX-M9 24 26 14 28 6 18 0,75 0,25 3 246 E. coli CTX-M9 29 30 22 30 6 20 <0,50 0,125 <4 248 E. coli CTX-M9 23 26 10 26 6 16 <0,50 0,094 <5,3 253 E. coli CTX-M9 28 30 16 28 6 18 <0,50 <0,064 ND 254 E. coli CTX-M9 20 25 14 24 6 14 <0,50 0,094 <5,3 258 E. coli CTX-M9 24 28 16 26 6 17 0,5 0,094 5,3 269 E. coli SHV 24 28 12 27 6 20 0,5 0,125 4 270 E. coli CTX-M9 24 28 8 27 6 20 1,5 0,38 3,9 273 E. coli CTX-M9 22 28 12 28 6 18 <0,50 0,19 <2,6 274 E. coli CTX-M9 26 29 14 30 6 21 <0,50 0,094 <5,3 282 E. coli SHV 23 23 6 24 6 21 0,5 0,094 5,3 284 E. coli SHV 25 25 10 23 6 17 0,5 0,094 5,3 CAZ: Ceftazidima (30 µg), CD02: Ceftazidima más ácido clavulánico (30/10 µg), CTX: Cefotaxima (30 µg), CD03: Cefotaxima más ácido clavulánico (30/10 µg), CPD: Cefpodoxima (10 µg), CD01: Cefpodoxima más ácido clavulánico (10/1 µg), TZ: Ceftazidima, TZL: Ceftazidima más ácido clavulánico RATIO TZ/TZL: Cociente entre la CMI de ceftazidima y la CMI de ceftazidima-ácido clavulánico ND: Resultado Indeterminado (CMIs inferiores a los límites inferiores) 4. Resultados 285 4.11. Resultados del estudio de prevalencia Por último, durante los meses de Octubre y Noviembre de 2002, y de forma consecutiva, se aislaron 744 enterobacterias (357 E. coli, 132 K. pneumoniae, 43 K. oxytoca y 212 de otras especies) de 744 sujetos distintos cuyas muestras fueron analizadas en el servicio de Microbiología del Hospital Universitario ?San Cecilio? de Granada. Todas ellas se identificaron por el sistema automatizado WIDER y se analizó la producción de BLEEs mediante el método A. Con el método de referencia hubo 50 aislados clínicos de E. coli, 2 de K. pneumoniae y 2 de K. oxytoca que confirmaron la presencia de BLEEs, que, respecto al total de cada especie, representan el 14% de E. coli, 1,5% de K. pneumoniae y 4,6% de K. oxytoca. El 10,2% de los aislados de estas especies producían una BLEE. Centrándonos en estas cepas, destacó el predominio de E. coli (92,6% de los aislados productores de BLEEs), y como origen las muestras extrahospitalarias (40; 80%), siendo 39 orinas (97,5%) y 1 secreción uretral (2,5%). En las muestras hospitalarias (10; 20%) se redujeron los aislamientos de E. coli en las de orina (6; 60%) y se incrementaron en las de secreciones de heridas (3; 30%) y de vulva (1; 10%). De entre los aislados sólo hubo 4 Klebsiella spp. (7,4% de los aislados productores de BLEEs), 3 en muestras de orinas extrahospitalarias (75%, 2 K. oxytoca y 1 K. pneumoniae), y 1 aislado de K. pneumoniae (25%) en una muestra de orina intrahospitalaria. Globalmente, el 66,7% de los aislados procedieron de mujeres. Betalactamasas de espectro extendido 286 4.12. Resultados del estudio de clonalidad mediante electroforesis en campo pulsado En la figura 222 (A y B) se observan los distintos patrones de electroforesis en campo pulsado obtenidos en los 10 aislamientos de E. coli de origen intrahospitalario aislados en el periodo Octubre- Noviembre de 2002. A B Figura 222 A: Resultados de la electroforesis en campo pulsado Líneas 1 y 12: Patrón de peso molecular Lambda Ladder PFG Marker (BioLabs,EEUU) Lïneas 2 a 11: Aislados 218, 235, 261, 246, 248, 255, 258 y 260, respectivamente Figura 222 B: Resultados de la electroforesis en campo pulsado Línea 1: Patrón de peso molecular Lambda Ladder PFG Marker (BioLabs) Líneas 2 y 3: Aislados 224 y 227, respectivamente Se puede observar que existe una gran variabilidad genética, detectándose 10 patrones distintos entre los 10 aislados hospitalarios estudiados. Se puede descartar, por tanto, la existencia de una relación clonal entre ellos. 4. Resultados 287 4.13. Resultados del análisis estadístico inferencial 4.13.1. Variables demográficas En la tabla 96 se resumen los resultados obtenidos tras la aplicación de la prueba exacta de Fisher para comparar los distintos grupos de estudio en función de las diferentes variables demográficas analizadas. Tabla 96: Comparación entre los distintos grupos de estudio, en función de las variables especie bacteriana, sexo, procedencia y tipo de muestra Ausencia (n=344) Presencia (n=125) p CTX-M9 (n=67) SHV (n=58) p E. coli 284 (82,6%) 115 (92%) 67 (100%) 48 (82,8%) K. pneumoniae 40 (11,6%) 8 (6,4%) 0 8 (13,8%) K. oxytoca 20 (5,8%) 2 (1,6%) 0,029 0 2 (3,4%) <0,001 Mujer 232 (67,4%) 86 (68,8%) 50 (74,6%) 36 (62,1%) Varón 112 (32,6%) 39 (31,2%) 0,824 17 (25,4%) 22 (37,9%) 0,175 Intrahospitalarias 80 (23,3%) 32 (25,6%) 18 (26,9%) 14 (24,1%) Extrahospitalarias 264 (76,7%) 93 (74,4%) 0,625 49 (73,1%) 44 (75,9%) 0,838 Orina 316 (91,8%) 108 (86,4%) 58 (86,5%) 50 (86,3%) Exudado quirúrgico 16 (4,7%) 9 (7,2%) 6 (9%) 3 (5,2%) Secreción genital 4 (1,2%) 3 (2,4%) 1 (1,5%) 2 (3,4%) Escara/úlcera 8 (2,3%) 0 0 0 Sonda vesical 0 2 (1,6%) 1 (1,5%) 1 (1,7%) Otros 0 3 (2,4%) 0,002 1 (1,5%) 2 (3,4%) 0,814 Al comparar entre sí los grupos de aislados productores y no productores de BLEEs podemos observar que la distribución fue igual en ambos grupos respecto al sexo (p=0,824) y procedencia de las muestras (p=0,625); sin embargo, hubo diferencias significativas entre ambos Betalactamasas de espectro extendido 288 grupos al ser comparados respecto a la distribución de especies bacterianas (p=0,029) y tipo de muestra (p=0,002). Asimismo, los aislamientos en el grupo de productores de enzimas CTX-M9 se distribuyeron de igual forma que en el grupo de aislados productores de enzimas SHV en cuanto a las variables sexo (p=0,175), procedencia de la muestra (p=0,838) y tipo de muestra (p=0,814); pero la distribución fue significativamente diferente en cuanto a especie (p<0,001), puesto que sólo en el grupo de aislados productores de SHV encontramos K. pneumoniae y K. oxytoca. 4.13.2. Distribuciones de CMIs obtenidas mediante E-test en los aislados productores de BLEEs Tras realizar la prueba de Kruskal-Wallis se obtuvo que: Comparadas las distribuciones de TZ en los dos grupos de aislados productores de BLEEs observamos que hay diferencias significativas entre ellas (p<0,001), significación que proviene del hecho de que el tipo SHV tiende a dar valores mayores de TZ que el tipo CTX- M9. Para TZL no hay diferencias significativas entre las distribuciones, (p=0,812), por lo que no podemos decir que, en este caso, la distribución de un grupo esté por encima de la distribución del otro. Comparadas las distribuciones de CT en los dos tipos de aislados se obtiene que hay diferencias significativas entre ellas (p<0,001), significación que proviene del hecho de que el tipo CTX-M9 tiende a dar valores mayores de CT que el tipo SHV. Para CTL se obtiene que hay diferencias significativas entre ellas, (p=0,027), significación que proviene del hecho de que el tipo CTX-M9 tiende a dar valores mayores de CTL que el tipo SHV. 4. Resultados 289 4.13.3. Antibióticos betalactámicos estudiados mediante el sistema VITEK 2 En las tablas 97 a 102 se muestran los resultados obtenidos tras la aplicación de la prueba exacta de Fisher, para comparar los distintos grupos de estudio, en cuanto a la actividad (en términos de CMIs y categorías clínicas) de los diferentes antibióticos betalactámicos estudiados por el sistema VITEK 2. Tabla 97: Relación entre la presencia de BLEEs y la distribución de las CMIs de amoxicilina-ácido clavulánico obtenida mediante el sistema VITEK 2 <2/1 4/2 8/4 16/8 >32/16 p Presencia 10 (8%) 74 (59,2%) 23 (18,4%) 16 (12,8%) 2 (1,6%) Ausencia 80 (23,3%) 152 (44,2%) 32 (9,3%) 44 (12,8%) 36 (10,5%) <0,001 CTX-M9 2 (3%) 43 (64,2%) 14 (20,9%) 7 (10,4%) 1 (1,5%) SHV 8 (13,8%) 31 (53,4%) 9 (15,5%) 9 (15,5%) 1 (1,7%) 0,170 Tabla 98: Relación entre la presencia de BLEEs y la distribución de las CMIs de piperacilina-tazobactam obtenida mediante el sistema VITEK 2 <4/4 8/4 32/4 64/4 p Presencia 113 (90,4%) 9 (7,2%) 1 (0,8%) 2 (1,6%) Ausencia 300 (87,2%) 36 (10,5%) 0 8 (2,3%) 0,265 CTX-M9 62 (92,5%) 3 (4,5%) 1 (1,5%) 1 (1,5%) SHV 51 (87,9%) 6 (10,3%) 0 1 (1,7%) 0,649 Betalactamasas de espectro extendido 290 Tabla 99: Relación entre los aislados productores o no de BLEEs y la distribución de las CMIs de los diferentes antibióticos betalactámicos estudiados mediante el sistema VITEK 2 Antibiótico BLEE <0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 >128 p Presencia 0 0 0 0 125 (100%) Ampicilina Ausencia 24 (7%) 20 (5,8%) 16 (4,7%) 28 (8,1%) 256 (74,4%) <0,001 Presencia 0 1 (0,8%) 2 (1,6%) 26 (20,8%) 18 (14,4%) 78 (62,4%) Piperacilina Ausencia 124 (36%) 20 (5,8%) 48 (14%) 56 (16,3%) 20 (5,8%) 76 (22,1%) <0,001 Presencia 0 0 0 0 0 125 (100%) Cefalotina Ausencia 36 (10,5%) 68 (19,8%) 20 (5,8%) 100 (29,1%) 44 (12,8%) 76 (22,1%) <0,001 Presencia 0 0 2 (1,6%) 4 (3,2%) 17 (13,6%) 10 (8%) 92 (73,6%) Cefuroxima Ausencia 28 (8,1%) 16 (4,7%) 168 (48,8%) 12 (3,5%) 80 (23,3%) 20 (5,8%) 20 (5,8%) <0,001 Presencia 83 (66,4%) 23 (18,4%) 13 (10,4%) 5 (4%) 1 (0,8%) Cefoxitina Ausencia 236 (68,6%) 16 (4,7%) 32 (9,3%) 28 (8,1%) 32 (9,3%) <0,001 Presencia 4 (3,2%) 8 (6,4%) 22 (17,6%) 37 (29,6%) 12 (9,6%) 6 (4,8%) 36 (28,8%) Cefotaxima Ausencia 340 (98,8%) 0 0 4 (1,2%) 0 0 0 <0,001 Presencia 1 (0,8%) 0 0 0 3 (2,4%) 121 (96,8%) Cefpodoxima Ausencia 206 (59,9%) 8 (2,3%) 42 (12,2%) 60 (17,4%) 8 (2,3%) 20 (5,8%) <0,001 Presencia 67 (53,6%) 5 (4%) 7 (5,6%) 2 (1,6) 33 (26,4%) 1 (0,8%) 10 (8%) Ceftazidima Ausencia 332 (96,5%) 8 (2,3%) 4 (1,2%) 0 0 0 0 <0,001 Presencia 66 (52,8%) 47 (37,6%) 1 (0,8%) 5 (4%) 1 (0,8%) 3 (2,4%) 2 (1,6%) Cefepime Ausencia 344 (100%) 0 0 0 0 0 0 <0,001 Presencia 125 (100%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Meropenem Ausencia 344 (100%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1,000 4. Resultados 291 Tabla 100: Relación entre los aislados productores de CTX-M9 y de SHV y la distribución de las CMIs de los diferentes antibióticos betalactámicos estudiados mediante el sistema VITEK 2 Antibiótico BLEE <0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 >128 P CTX-M9 0 0 0 0 0 0 0 67 (100%) Ampicilina SHV 0 0 0 0 0 0 0 58 (100%) 1,000 CTX-M9 0 0 0 0 0 0 0 11 (16,4%) 9 (13,4%) 47 (70,1%) Piperacilina SHV 0 0 0 0 0 1 (1,7%) 2 (3,4%) 15 (25,9%) 9 (15,5%) 31 (53,4%) 0,139 CTX-M9 0 0 0 0 0 0 0 0 67 (100%) Cefalotina SHV 0 0 0 0 0 0 0 0 58 (100%) 1,000 CTX-M9 0 0 0 0 0 0 1 (1,5%) 0 66 (98,5%) Cefuroxima SHV 0 0 0 0 2 (3,4%) 4 (6,9%) 16 (27,6%) 10 (17,2%) 26 (44,8%) <0,001 CTX-M9 39 (58,2%) 14 (29,9%) 9 (13,4%) 4 (6%) 1 (1,5%) Cefoxitina SHV 44 (75,9%) 9 (15,5%) 4 (6,9%) 1 (1,7%) 0 0,222 CTX-M9 0 2 (3%) 4 (6%) 23 (34,3%) 10 (14,9%) 3 (4,5%) 25 (37,3%) Cefotaxima SHV 4 (6,9%) 6 (10,3%) 18 (31%) 14 (24,1%) 2 (3,4%) 3 (5,2%) 11 (19%) <0,001 CTX-M9 0 0 0 0 2 (3%) 65 (97%) Cefpodoxima SHV 1 (1,7%) 0 0 0 1 (1,7%) 56 (96,6%) 0,785 CTX-M9 58 (86,6%) 4 (6%) 2 (3%) 0 3 (4,5%) 0 0 Ceftazidima SHV 9 (15,5%) 1 (1,7%) 5 (8,6%) 2 (3,4%) 30 (51,7%) 1 (1,7%) 10 (17,2%) <0,001 CTX-M9 26 (38,8%) 36 (53,7%) 0 0 1 (1,5%) 3 (4,5%) 1 (1,5%) Cefepime SHV 40 (69%) 11 (19%) 1 (1,7%) 5 (8,6%) 0 0 1 (1,7%) <0,001 CTX-M9 67 (100%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Meropenem SHV 58 (100%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1,000 Betalactamasas de espectro extendido 292 Tabla 101: Relación entre los aislados productores o no de BLEEs y la sensibilidad a los diferentes antibióticos betalactámicos estudiados mediante el sistema VITEK 2 (resistente equivale a cualquier grado de resistencia: I ó R) Presencia de BLEEs (n=125) Ausencia de BLEEs (n=344) Antibióticos Sensible Resistente Sensible Resistente p Ampicilina 0 125 (100%) 60 (17,4%) 284 (82,6%) <0,001 Amoxicilina-ác. clavulánico 107 (85,6%) 18 (14,4%) 264 (76,7%) 80 (23,3%) 0,040 Piperacilina 3 (2,4%) 122 (97,6%) 192 (55,8%) 152 (44,2%) <0,001 Piperacilina- tazobactam 122 (97,6%) 3 (2,4%) 336 (97,7%) 8 (2,3%) 1,000 Cefalotina 0 125 (100%) 124 (36%) 220 (64%) <0,001 Cefuroxima 6 (4,8%) 119 (95,2%) 224 (65,1%) 120 (34,9%) <0,001 Cefoxitina 106 (84,8%) 19 (15,2%) 252 (73,3%) 92 (26,7%) 0,010 Cefotaxima 71 (56,8%) 54 (43,2%) 344 (100%) 0 <0,001 Cefpodoxima 1 (0,8%) 124 (99,2%) 316 (91,9%) 28 (8,1%) <0,001 Ceftazidima 81 (64,8%) 44 (35,2%) 344 (100%) 0 <0,001 Cefepime 119 (95,2%) 6 (4,8%) 344 (100%) 0 <0,001 Meropenem 125 (100%) 0 344 (100%) 0 1,000 4. Resultados 293 Tabla 102: Relación entre los aislados productores de CTX-M9 y de SHV y la sensibilidad a los diferentes antibióticos betalactámicos ensayados mediante el sistema VITEK 2 (resistente equivale a cualquier grado de resistencia: I ó R) CTX-M9 (n=67) SHV (n=58) Antibiótico Sensible Resistente Sensible Resistente p Ampicilina 0 67 (100%) 0 58 (100%) 1,000 Amoxicilina-ác. clavulánico 59 (88,1%) 8 (11,9%) 48 (82,8%) 10 (17,2%) 0,451 Piperacilina 0 67 (100%) 3 (5,2%) 55 (94,8%) 0,097 Piperacilina- tazobactam 65 (97%) 2 (3%) 57 (98,3%) 1 (1,7%) 1,000 Cefalotina 0 67 (100%) 0 58 (100%) 1,000 Cefuroxima 0 67 (100%) 6 (10,3%) 52 (89,7%) 0,009 Cefoxitina 53 (79,1%) 14 (20,9%) 53 (91,4%) 5 (8,6%) 0,080 Cefotaxima 29 (43,3%) 38 (56,7%) 42 (72,4%) 16 (27,6%) 0,001 Cefpodoxima 0 67 (100%) 1 (1,7%) 57 (98,3%) 0,464 Ceftazidima 64 (95,5%) 3 (4,5%) 17 (29,3%) 41 (70,7%) <0,001 Cefepime 62 (92,5%) 5 (7,5%) 57 (98,3%) 1 (1,7%) 0,215 Meropenem 67 (100%) 0 58 (100%) 0 1,000 Según los resultados obtenidos se puede observar que: 1. El grupo de aislados productores de BLEEs y el de no productores presentaron entre sí diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad obtenida para los siguientes antibióticos betalactámicos (en todos ellos p<0,05, tanto para la distribución de sensibilidad según las CMIs, como por categoría clínica): ampicilina, amoxicilina- ácido clavulánico, piperacilina, cefalotina, cefuroxima, cefoxitina, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima y cefepime. Ampicilina, piperacilina, cefalotina, cefuroxima, y cefpodoxima presentaron menor actividad (mayor porcentaje de resistencias y mayor proporción de CMIs elevadas) entre los aislados Betalactamasas de espectro extendido 294 productores de BLEEs vs. los no productores. Lo mismo ocurrió con cefotaxima, ceftazidima y cefepime, para los que no hubo aislados resistentes en el grupo de no productores de BLEEs. Amoxicilina-ácido clavulánico y cefoxitina presentaron, al contrario que las anteriores, menor actividad en los aislados no productores de BLEEs. 2. El grupo de aislados productores de BLEEs y el de no productores no presentaron entre sí diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad obtenida para los siguientes antibióticos betalactámicos (en todos ellos p>0,05, tanto para la distribución de sensibilidad según las CMIs, como por categoría clínica): piperacilina-tazobactam y meropenem. En los dos grupos predominaron los aislados sensibles a estos antibióticos. 3. El grupo de aislados productores de enzimas CTX-M9 y el de SHV presentaron entre sí diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad obtenida para los siguientes antibióticos betalactámicos (en todos ellos p<0,05, tanto para la distribución de sensibilidad según las CMIs, como por categoría clínica): cefuroxima, cefotaxima y ceftazidima. Cefuroxima y cefotaxima presentaron menor actividad en los aislados productores de CTX-M9 que en los productores de SHV. Sin embargo, ceftazidima presentó menor actividad en los aislados productores de SHV que en los productores de CTX-M9. 4. Los aislados productores de enzimas CTX-M9 y de SHV no presentaron entre sí diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad observada para los siguientes antibióticos betalactámicos (en todos ellos p>0,05, tanto para la distribución de sensibilidad según las CMIs, como por categoría clínica): ampicilina, amoxicilina- ácido clavulánico, piperacilina, piperacilina-tazobactam, cefalotina, cefoxitina, cefpodoxima y meropenem. 4. Resultados 295 Ampicilina, piperacilina, cefalotina y cefpodoxima se mostraron poco activos en ambos grupos de aislados; mientras que amoxicilina-ácido clavulánico, piperacilina-tazobactam, cefoxitina y meropenem se mostraron muy activos en ambos grupos. 5. Hubo diferencias significativas entre los grupos de aislados productores de CTX-M9 y el de SHV en la distribución de las CMIs de cefepime (p<0,001), pero no las hubo cuando se analizaron por categorías clínicas (p=0,215). Cefepime mostró más actividad (mayor porcentaje de CMIs bajas) en el grupo de aislados productores de SHV. 4.13.4. Antibióticos no betalactámicos estudiados mediante el sistema VITEK 2 En las tablas 103 a 108 aparecen los resultados obtenidos, de la aplicación de la prueba exacta de Fisher, al comparar los distintos grupos de estudio en cuanto a la actividad (en términos de CMIs y categorías clínicas) de los diferentes antibióticos no betalactámicos ensayados mediante el sistema VITEK 2. Betalactamasas de espectro extendido 296 Tabla 103: Relación entre los aislados productores o no de BLEEs y la distribución de CMIs de los diferentes antibióticos no betalactámicos estudiados mediante el sistema VITEK 2 Antibiótico BLEE <0,25 0,5 1 2 4 8 16 >16 P Presencia 120 (96%) 1 (0,8%) 3 (2,4%) 1 (0,8%) 0 Amikacina Ausencia 304 (88,4%) 32 (9,3%) 4 (1,2%) 4 (1,2%) 0 0,010 Presencia 100 (80%) 0 4 (3,2%) 3 (2,4%) 18 (14,4%) Gentamicina Ausencia 244 (70,9%) 20 (5,8%) 16 (4,7%) 4 (1,2%) 60 (17,4%) 0,035 Presencia 101 (80,8%) 4 (3,2%) 0 9 (7,2%) 11 (8,8%) Tobramicina Ausencia 268 (77,9%) 16 (4,7%) 8 (2,3%) 28 (8,1%) 24 (7%) 0,416 Presencia 32 (25,6%) 1 (0,8%) 7 (5,6%) 4 (3,2%) 81 (64,8%) Ciprofloxacino Ausencia 160 (46,5%) 4 (1,2%) 28 (8,1%) 4 (1,2%) 148 (43%) <0,001 Presencia 27 (21,6%) 4 (3,2%) 11 (8,8%) 1 (0,8%) 6 (4,8%) 76 (60,8%) Norfloxacino Ausencia 152 (44,2%) 0 44 (12,8%) 0 16 (4,7%) 132 (38,4%) <0,001 Presencia 26 (20,8%) 0 3 (2,4%) 10 (8%) 4 (3,2%) 82 (65,6%) Ofloxacino Ausencia 144 (41,9%) 0 16 (4,7%) 28 (8,1%) 4 (1,2%) 152 (44,2%) <0,001 Tabla 104: Relación entre los aislados productores de CTX-M9 y de SHV, en función de la distribución de CMIs de los antibióticos no betalactámicos estudiados mediante el sistema VITEK 2 Antibiótico BLEE <0,25 0,5 1 2 4 8 16 >16 P CTX-M9 67 (100%) 0 0 0 0 Amikacina SHV 53 (91,4%) 1 (1,7%) 3 (5,2%) 1 (1,7%) 0 0,020 CTX-M9 59 (88,1%) 0 2 (3%) 0 6 (9%) Gentamicina SHV 41 (70,7%) 0 2 (3,4%) 3 (5,2%) 12 (20,7%) 0,038 CTX-M9 59 (88,1%) 3 (4,5%) 0 3 (4,5%) 2 (3%) Tobramicina SHV 42 (72,4%) 1 (1,7%) 0 6 (10,3%) 9 (15,5%) 0,026 CTX-M9 11 (16,4%) 1 (1,5%) 6 (9%) 3 (4,5%) 46 (68,7%) Ciprofloxacino SHV 21 (36,2%) 0 1 (1,7%) 1 (1,7%) 35 (60,3%) 0,027 CTX-M9 9 (13,4%) 3 (4,5%) 7 (10,4%) 1 (1,5%) 5 (7,5%) 42 (62,7%) Norfloxacino SHV 18 (31%) 1 (1,7%) 4 (6,9%) 0 1 (1,7%) 34 (58,6%) 0,097 CTX-M9 8 (11,9%) 0 2 (3%) 7 (10,4%) 3 (4,5%) 47 (70,1%) Ofloxacino SHV 18 (31%) 0 1 (1,7%) 3 (5,2%) 1 (1,7%) 35 (60,3%) 0,081 4. Resultados 297 Tabla 105: Relación entre los grupos de estudio en cuanto a la distribución de las CMIs de nitrofurantoína obtenida mediante el sistema VITEK 2 <16 32 64 128 256 p Presencia 51 (40,8%) 37 (29,6%) 26 (20,8%) 9 (7,2%) 2 (1,6%) Ausencia 228 (66,3%) 44 (12,8%) 28 (8,1%) 28 (8,1%) 16 (4,7%) <0,001 CTX-M9 26 (38,8%) 20 (29,9%) 15 (22,4%) 5 (7,5%) 1 (1,5%) SHV 25 (43,1%) 17 (29,3%) 11 (19%) 4 (6,9%) 1 (1,7%) 0,978 Tabla 106: Relación entre los grupos de estudio en cuanto a la distribución de las CMIs de cotrimoxazol obtenida mediante el sistema VITEK 2 <20 40 80 >320 p Presencia 61 (48,8%) 1 (0,8%) 0 63 (50,4%) Ausencia 192 (55,8%) 0 4 (1,2%) 148 (43%) 0,078 CTX-M9 27 (40,3%) 0 0 40 (59,7%) SHV 34 (58,6%) 1 (1,7%) 0 23 (39,7%) 0,038 Tabla 107: Relación entre los aislados productores o no de BLEEs y la sensibilidad a los antibióticos no betalactámicos estudiados mediante el sistema VITEK 2 (resistente equivale a cualquier grado de resistencia: I ó R) Presencia de BLEE (n=125) Ausencia de BLEE (n=344) Antibiótico Sensible Resistente Sensible Resistente p Amikacina 125 (100%) 0 344 (100%) 0 1,000 Gentamicina 104 (83,2%) 21 (16,8%) 280 (81,4%) 64 (18,6%) 0,687 Tobramicina 105 (84%) 20 (16%) 292 (84,9%) 52 (15,1%) 0,885 Ciprofloxacino 40 (32%) 85 (68%) 192 (55,8%) 152 (44,2%) <0,001 Norfloxacino 43 (34,4%) 82 (65,6%) 196 (57%) 148 (43%) <0,001 Ofloxacino 39 (31,2%) 86 (68,8%) 184 (53,5%) 160 (46,5%) <0,001 Nitrofurantoína 88 (70,4%) 37 (29,6%) 272 (79,1%) 72 (20,9%) 0,063 Cotrimoxazol 62 (49,6%) 63 (50,4%) 192 (55,8%) 152 (44,2%) 0.250 Betalactamasas de espectro extendido 298 Tabla 108: Relación entre los aislados productores de´CTX-M9 y de SHV y la sensibilidad a los antibióticos no betalactámicos estudiados mediante el sistema VITEK 2 (resistente equivale a cualquier grado de resistencia: I ó R) CTX-M9 (n=67) SHV (n=58) Antibiótico Sensible Resistente Sensible Resistente p Amikacina 67 (100%) 0 58 (100%) 0 1,000 Gentamicina 61 (91%) 6 (9%) 43 (74,1%) 15 (25,9%) 0,016 Tobramicina 62 (92,5%) 5 (7,5%) 43 (74,1%) 15 (25,9%) 0,007 Ciprofloxacino 18 (26,9%) 49 (73,1%) 22 (37,9%) 36 (62,1%) 0,249 Norfloxacino 20 (29,9%) 47 (70,1%) 23 (39,7%) 35 (60,3%) 0,264 Ofloxacino 17 (25,4%) 50 (74,6%) 22 (37,9%) 36 (62,1%) 0.175 Nitrofurantoína 46 (68,7%) 21 (31,3%) 42 (72,4%) 16 (27,6%) 0,697 Cotrimoxazol 27 (40,3%) 40 (59,7%) 35 (60,3%) 23 (39,7%) 0,032 Según los resultados obtenidos se puede observar que: 1. Los aislados productores y no productores de BLEEs presentaron entre sí diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad observada para las quinolonas ensayadas (ciprofloxacino, norfloxacino y ofloxacino), en todos ellos p<0,05, tanto para la distribución de sensibilidad según las CMIs, como por categoría clínica. Las quinolonas presentaron menor actividad (mayor porcentaje de resistencias y mayor proporción de CMIs elevadas) sobre los aislados productores de BLEEs que en los no productores. 2. Los aislados productores de BLEEs y los no productores no presentaron entre sí diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad obtenida para tobramicina y cotrimoxazol (en todos ellos p>0,05, tanto para la distribución de sensibilidad según las CMIs, como por categoría clínica). En los dos grupos predominaron los 4. Resultados 299 aislados sensibles a tobramicina y se repartieron equitativamente respecto a la sensibilidad a cotrimoxazol. 3. Hubo diferencias significativas entre los aislados productores de BLEEs y los no productores, en cuanto a la distribución de las CMIs de amikacina (p=0,010), gentamicina (p=0,035) y nitrofurantoína (p<0,001), pero no las hubo cuando se analizaron las categorías clínicas en ambos grupos para estos antibióticos (p=1,000; p=0,687 y p=0,063, respectivamente). Amikacina y gentamicina mostraron un mayor porcentaje de CMIs bajas en el grupo de aislados productores de BLEEs, mientras que nitrofurantoína las presentó en el grupo de aislados no productores de BLEEs. 4. Los aislados productores de enzimas CTX-M9 y de SHV presentaron entre sí diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad a gentamicina, tobramicina y cotrimoxazol (en todos ellos p<0,05, tanto para la distribución de sensibilidad según las CMIs, como por categoría clínica). Cotrimoxazol presentó menor actividad en los aislados productores de CTX-M9. Sin embargo, gentamicina y tobramicina presentaron menor actividad en los aislados productores de SHV. 5. Los aislados productores de enzimas CTX-M9 y de SHV no presentaron entre sí diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad mostrada a norfloxacino, ofloxacino y nitrofurantoína (en todos ellos p>0,05, tanto para la distribución de sensibilidad según las CMIs, como por categoría clínica). Los tres antibióticos se mostraron poco activos en ambos grupos de aislados. 6. Hubo diferencias significativas entre los aislados productores de CTX-M9 y de SHV en la distribución de las CMIs de amikacina (p=0,020) y ciprofloxacino (p=0,027), pero no las hubo cuando se analizaron las categorías clínicas en ambos grupos para estos Betalactamasas de espectro extendido 300 antibióticos (p=1,000 y p=0,249, respectivamente). Amikacina mostró un mayor porcentaje de CMIs bajas en los aislados productores de CTX-M9, mientras que ciprofloxacino las presentó en el grupo de aislados SHV. 4.13.5. Antibióticos betalactámicos estudiados mediante el sistema WIDER En las tablas 109 a 115 aparecen los resultados obtenidos tras la aplicación de la prueba exacta de Fisher, al comparar los grupos de estudio en función de la actividad (en términos de CMIs y categorías clínicas) de los diferentes antibióticos betalactámicos estudiados mediante el sistema WIDER. Tabla 109: Relación entre los aislados productores o no de BLEEs y la distribución de las CMIs de los antibióticos betalactámicos estudiados mediante el sistema WIDER Antibiótico BLEE <1 1 2 4 8 16 >16 p Presencia 1 (0,8%) 0 0 0 124 (99,2%) Amoxicilina Ausencia 44 (12,8%) 0 16 (4,7%) 0 284 (82,6%) <0,001 Presencia 0 0 125 (100%) Cefalotina Ausencia 72 (20,9%) 24 (7%) 248 (72,1%) <0,001 Presencia 1 (0,8%) 0 1 (0,8%) 5 (4%) 118 (94,4%) Cefuroxima Ausencia 76 (22,1%) 68 (19,8%) 44 (12,8%) 92 (26,7%) 64 (18,6%) <0,001 Presencia 61 (48,8%) 1 (0,8%) 19 (15,2%) 44 (35,2%) Cefoxitina Ausencia 44 (12,8%) 24 (7%) 84 (24,4%) 192 (55,8%) <0,001 Presencia 0 0 0 1 (0,8%) 2 (1,6%) 122 (97,6%) Cefotaxima Ausencia 124 (36%) 48 (14%) 52 (15,1%) 52 (15,1%) 28 (8,1%) 40 (11,6%) <0,001 Presencia 20 (16%) 2 (1,6%) 18 (14,4%) 4 (3,2%) 11 (8,8%) 8 (6,4%) 62 (49,6%) Ceftazidima Ausencia 76 (22,1%) 12 (3,5%) 68 (19,8%) 48 (14%) 72 (20,9%) 32 (9,3%) 36 (10,5%) <0,001 Presencia 5 (4%) 0 5 (4%) 5 (4%) 6 (4,8%) 4 (3,2%) 100 (80%) Cefepime Ausencia 152 (44,2%) 36 (10,5%) 52 (15,1%) 52 (15.1%) 16 (4.7%) 16 (4,7%) 20 (5,8%) <0,001 Presencia 120 (96%) 4 (3,2%) 0 0 0 1 (0,8%) Meropenem Ausencia 308 (89,5%) 28 (8,1%) 0 0 0 8 (2,3%) 0,090 4. Resultados 301 Tabla 110: Relación entre los aislados productores de CTX-M9 y de SHV y la distribución de las CMIs de los antibióticos betalactámicos estudiados mediante el sistema WIDER Antibiótico BLEE <1 1 2 4 8 16 >16 p CTX-M9 1 (1,5%) 0 0 0 66 (98,5%) Amoxicilina SHV 0 0 0 0 58 (100%) 1,000 CTX-M9 0 0 0 0 0 67 (100%) Cefalotina SHV 0 0 0 0 0 58 (100%) 1,000 CTX-M9 1 (1,5%) 0 0 0 66 (98,5%) Cefuroxima SHV 0 0 1 (1,7%) 5 (8,6%) 52 (89,7%) 0,013 CTX-M9 27 (40,3%) 1 (1,5%) 11 (16,4%) 28 (41,8%) Cefoxitina SHV 34 (58,6%) 0 8 (13,8%) 16 (27,6%) 0,149 CTX-M9 0 0 0 0 0 67 (100%) Cefotaxima SHV 0 0 0 1 (1,7%) 2 (3,4%) 55 (94,8%) 0,097 CTX-M9 15 (22,4%) 2 (3%) 14 (20,9%) 1 (1,5%) 9 (13,4%) 6 (9%) 20 (29,9%) Ceftazidima SHV 5 (8,6%) 0 4 (6,9%) 3 (5,2%) 2 (3,4%) 2 (3,4%) 42 (72,4%) <0,001 CTX-M9 0 0 1 (1,5%) 2 (3%) 2 (3%) 1 (1,5%) 61 (91%) Cefepime SHV 5 (8,6%) 0 4 (6,9%) 3 (5,2%) 4 (6,9%) 3 (5,2%) 39 (67,2%) 0,014 CTX-M9 64 (95,5%) 3 (4,5%) 0 0 0 0 Meropenem SHV 56 (96,6%) 1 (1,7%) 0 0 0 1 (1,7%) 0,471 Betalactamasas de espectro extendido 302 Tabla 111: Relación entre los grupos de estudio y la distribución de las CMIs de amoxicilina-ácido clavulánico obtenida mediante el sistema WIDER <4/2 8/4 16/8 >16/8 p Presencia 36 (28,8%) 51 (40,8%) 25 (20%) 13 (10,4%) Ausencia 64 (18,6%) 76 (22,1%) 100 (29,1%) 104 (30,2%) <0,001 CTX-M9 21 (31,3%) 26 (38,8%) 11 (16,4%) 9 (13,4%) SHV 15 (25,9%) 25 (43,1%) 14 (24,1%) 4 (6,9%) 0,455 Tabla 112: Relación entre los grupos de estudio y la distribución de las CMIs de piperacilina-tazobactam obtenida mediante el sistema WIDER <16/4 32/4 64/4 >64/4 p Presencia 84 (67,2%) 3 (2,4%) 7 (5,6%) 31 (24,8%) Ausencia 224 (65,1%) 8 (2,3%) 40 (11,6%) 72 (20,9%) 0,267 CTX-M9 43 (64,2%) 2 (3%) 6 (9%) 16 (23,9%) SHV 41 (70,7%) 1 (1,7%) 1 (1,7%) 15 (25,9%) 0,395 Tabla 113: Relación entre los grupos de estudio y la distribución de las CMIs de ceftazidima-ácido clavulánico obtenida mediante el sistema WIDER <1/4 8/4 >8/4 p Presencia 109 (87,2%) 13 (10,4%) 3 (2,4%) Ausencia 292 (84,9%) 24 (7%) 28 (8,1%) 0,045 CTX-M9 57 (85,1%) 9 (13,4%) 1 (1,5%) SHV 52 (89,7%) 4 (6,9%) 2 (3,4%) 0,436 4. Resultados 303 Tabla 114: Relación entre los aislados productores o no de BLEEs y la sensibilidad a los antibióticos betalactámicos estudiados mediante el sistema WIDER (resistente equivale a cualquier grado de resistencia: I ó R) Presencia de BLEE (n=125) Ausencia de BLEE (n=344) Antibiótico Sensible Resistente Sensible Resistente p Amoxicilina 1 (0,8%) 124 (99,2%) 60 (17,4%) 284 (82,6%) <0,001 Amoxicilina- ác. clavulánico 87 (69,6%) 38 (30,4%) 140 (40,7%) 204 (59,3%) <0,001 Piperacilina- tazobactam 84 (67,2%) 41 (32,8%) 224 (65,1%) 120 (34,9%) 0,742 Cefalotina 0 125 (100%) 96 (27,9%) 248 (72,1%) <0,001 Cefuroxima 1 (0,8%) 124 (99,2%) 144 (41,9%) 200 (58,1%) <0,001 Cefoxitina 62 (49,6%) 63 (50,4%) 68 (19,8%) 276 (80,2%) <0,001 Cefotaxima 3 (2,4%) 122 (97,6%) 304 (88,4%) 40 (11,6%) <0,001 Ceftazidima 55 (44%) 70 (56%) 276 (80,2%) 68 (19,8%) <0,001 Cefepime 21 (16,8%) 104 (83,2%) 308 (89,5%) 36 (10,5%) <0,001 Meropenem 124 (99,2%) 1 (0,8%) 336 (97,7%) 8 (2,3%) 0,456 Betalactamasas de espectro extendido 304 Tabla 115: Relación entre los aislados productores de CTX-M9 y de SHV y la sensibilidad a los diferentes antibióticos betalactámicos estudiados mediante el sistema WIDER (resistente equivale a cualquier grado de resistencia: I ó R) CTX-M9 (n=67) SHV (n=58) Antibiótico Sensible Resistente Sensible Resistente p Amoxicilina 1 (1,5%) 66 (98,5%) 0 58 (100%) 1,000 Amoxicilina-ác. clavulánico 47 (70,1%) 20 (29,9%) 40 (69%) 18 (31%) 1,000 Piperacilina- tazobactam 43 (64,2%) 24 (35,8%) 41 (70,7%) 17 (29,3%) 0,453 Cefalotina 0 67 (100%) 0 58 (100%) 1,000 Cefuroxima 1 (1,5%) 66 (98,5%) 0 58 (100%) 1,000 Cefoxitina 28 (41,8%) 39 (58,2%) 34 (58,6%) 24 (41,4%) 0,074 Cefotaxima 0 67 (100%) 3 (5,2%) 55 (94,8%) 0,097 Ceftazidima 41 (61,2%) 26 (38,8%) 14 (24,1%) 44 (75,9%) <0,001 Cefepime 5 (7,5%) 62 (92,5%) 16 (27,6%) 42 (72,4%) 0,004 Meropenem 67 (100%) 0 57 (98,3%) 1 (1,7%) 0,464 Según los resultados obtenidos se puede observar que: 1. Los aislados productores de BLEEs y los no productores presentaron entre sí diferencias significativas en la sensibilidad obtenida para los siguientes antibióticos betalactámicos (en todos ellos p<0,05, tanto para la distribución de sensibilidad según las CMIs, como por categoría clínica): amoxicilina, amoxicilina-ácido clavulánico, cefalotina, cefuroxima, cefoxitina, cefotaxima, ceftazidima y cefepime. Amoxicilina, cefalotina, cefuroxima, cefotaxima, ceftazidima y cefepime tuvieron menor actividad (mayor porcentaje de resistencias y mayor proporción de CMIs elevadas) sobre los aislados productores de BLEEs, que en los no productores. 4. Resultados 305 Amoxicilina-ácido clavulánico y cefoxitina tuvieron, al contrario que las anteriores, menor actividad sobre los aislados no productores de BLEEs. 2. Los aislados productores de BLEEs y los no productores no presentaron entre sí diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad mostrada para los siguientes antibióticos betalactámicos (en todos ellos p>0,05, tanto para la distribución de sensibilidad según las CMIs, como por categoría clínica): piperacilina-tazobactam y meropenem. En los dos grupos predominaron los aislados sensibles a estos antibióticos. 3. Los aislados productores de enzimas CTX-M9 y de SHV presentaron entre sí diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad obtenida para los siguientes antibióticos betalactámicos (en todos ellos p<0,05, tanto para la distribución de sensibilidad según las CMIs, como por categoría clínica): ceftazidima y cefepime. Ceftazidima presentó menor actividad en los aislados productores de SHV que en los productores de CTX-M9. Sin embargo, cefepime presentó menor actividad en los aislados productores de CTX-M9 que en los productores de SHV. 4. Los aislados productores de enzimas CTX-M9 y de SHV no presentaron entre sí diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad obtenida para los siguientes antibióticos betalactámicos (en todos ellos p>0,05, tanto para la distribución de sensibilidad según las CMIs, como por categoría clínica): amoxicilina, amoxicilina-ácido clavulánico, piperacilina-tazobactam, cefalotina, cefoxitina, cefotaxima y meropenem. Amoxicilina, cefalotina, cefoxitina y cefotaxima se mostraron poco activos sobre ambos grupos de aislados, mientras que amoxicilina-ácido clavulánico, piperacilina-tazobactam, y meropenem se mostraron activos. Betalactamasas de espectro extendido 306 Hubo diferencias significativas entre los aislados productores de CTX-M9 y de SHV en la distribución de las CMIs de cefuroxima (p<0,013), pero no las hubo cuando se analizaron las categorías clínicas para este antibiótico (p=1,000). Cefuroxima mostró un mayor porcentaje de CMIs altas en el grupo de aislados productores de CTX-M9. 5. DISCUSIÓN 5. Discusión 309 Las cefalosporinas de tercera generación y, especialmente, cefotaxima y ceftazidima, han sido utilizadas ampliamente en el tratamiento de infecciones comunitarias y nosocomiales (Amyes y Miles, 1998), siendo de los antibióticos más empleados para el tratamiento de infecciones respiratorias, urinarias, abdominales, del sistema nervioso central y bacteriemias de diferentes orígenes. Se han introducido nuevos antibióticos (cefalosporinas de cuarta generación, nuevas quinolonas, carbapenémicos) que presentan un mayor espectro antibacteriano y que incluyen indicaciones coincidentes con las reconocidas para las cefalosporinas de tercera generación; sin embargo, estos antibióticos siguen siendo de primera elección en muchas situaciones clínicas. En un estudio realizado sobre 624 pacientes en 44 servicios de Medicina Intensiva (UCI) en España (Álvarez-Lerma et al., 2001), cefotaxima fue el tercer antibiótico más utilizado después de amoxicilina- ácido clavulánico y cefazolina. Fue el primer antibiótico prescrito para el tratamiento de infecciones de la comunidad y el quinto entre los usados para profilaxis de las mismas. Fue el primer antibiótico utilizado de forma empírica, de manera que en la mayoría de las ocasiones se indicó sin conocerse la etiología de la infección. Aunque en este estudio no se analizaron los mecanismos de resistencia frente a cefotaxima de los microorganismos aislados como causantes de la infección, en un 23,7% de los casos fue necesario modificar el tratamiento inicial en base a la resistencia detectada. El uso y, a veces, abuso, de las cefalosporinas de tercera generación tanto a nivel hospitalario, como, y más importante, a nivel comunitario, ha favorecido el incremento, desde el punto de vista epidemiológico, de nuevos mecanismos de resistencia, como son las betalactamasas de espectro extendido (Winokur et al., 2001). Debido a la gravedad e importancia de algunas infecciones por aislados productores de BLEEs, a la dificultad de tratamiento que entrañan, al comportamiento Betalactamasas de espectro extendido 310 epidemiológico, a la posibilidad de que puedan transmitirse a otros enfermos o a bacterias de la microbiota comensal, y a las limitaciones con los criterios habituales de sensibilidad, el papel del laboratorio de Microbiología Clínica para su detección es crucial. Éste debe estar preparado para reconocer la presencia de un fenotipo BLEE e iniciar un plan racional para el control de las infecciones que pudieran producirse. Desde el punto de vista técnico, el laboratorio de Microbiología se enfrenta a dos retos. Por una parte, el elevado número de enzimas con características de BLEE que se han descrito y cuyas diferencias fenotípicas, a veces, son muy sutiles. Por otra, la posibilidad de encontrar aislados de enterobacterias que producen enzimas que no deben ser consideradas estrictamente como BLEE, pero cuyo fenotipo puede, a veces, parecerse y confundirse, como la producción de la betalactamasa cromosómica AmpC, la codificación plasmídica del gen AmpC por parte de diversos miembros de la familia Enterobacteriaceae, la hiperproducción de betalactamasas plasmídicas clásicas (TEM-1, TEM-2 o SHV-1) o la presencia de la betalactamasa K1 en K. oxytoca. Con nuestro estudio hemos pretendido analizar cuáles son las características epidemiológicas de los microorganismos productores de BLEEs en nuestro medio, centrándonos en las especies E. coli, K. pneumoniae y K. oxytoca, aquellas para las que el NCCLS ha establecido normas para una correcta detección. Si bien es cierto que en otras especies bacterianas se ha descrito producción de BLEEs, no hay normas NCCLS establecidas, y por tanto no las consideraremos, a fin de poder realizar, además, una evaluación de distintos métodos de detección fenotípica de estas betalactamasas. 5. Discusión 311 5.1. Métodos de difusión con disco Los criterios del NCCLS para detección de BLEEs en E. coli y Klebsiella spp. (apartado 3.2.) están basados en la inhibición del enzima por los inhibidores de betalactamasas, utilizando para ello ácido clavulánico (NCCLS, 2003a; NCCLS, 2003b). Pueden emplearse varios substratos para permitir la detección de enzimas con baja capacidad hidrolítica para alguno de ellos: ceftazidima, cefotaxima, cefpodoxima, ceftriaxona o aztreonam. Estos criterios han sido validados por diferentes autores, encontrándose una buena sensibilidad y especificidad, superiores al 90% (Carter et al., 2000; Steward et al., 2001), pero que puede variar dependiendo de la colección utilizada para su análisis o de la prevalencia de aislados con BLEEs en el caso de evaluarse con aislados consecutivos. Nosotros hemos considerado de referencia para la detección de aislados productores de BLEEs, las normas NCCLS establecidas para la difusión con disco (NCCLS, 2003a). Para ello se usó la combinación de discos de cefpodoxima, cefotaxima y ceftazidima solos y en combinación con ácido clavulánico (Carter et al., 2000; Steward et al., 2001) descrita en el apartado 3.2.1. como método A. Tras la selección de los 469 aislados clínicos, éstos se dividieron en dos grupos, 125 productores de BLEEs y 344 no productores, en función de los resultados obtenidos tras la aplicación del método. Muchos autores han aportado resultados sobre la capacidad que cada una de estas cefalosporinas, por sí solas y en combinación con ácido clavulánico, tienen para confirmar la presencia de BLEEs en aquellos aislados que cumplen los criterios de cribado establecidos por el NCCLS (tablas 19 y 20). La mayor parte de ellos establecen que ceftazidima sola y en combinación con ácido clavulánico es el mejor procedimiento para detectar estos aislados, no obteniéndose resultados tan favorables para la combinación de cefotaxima y ácido clavulánico. Esto se puede deber a Betalactamasas de espectro extendido 312 que en la mayor parte de los estudios en los que se realiza este planteamiento los aislados clínicos estudiados, o las cepas con BLEEs conocidas ensayadas, eran preferentemente productoras de enzimas SHV y TEM (Vercauteren et al., 1997; Ho et al., 1998; Hadziyannis et al., 2000), y en muy pocos casos en estos estudios aparecen enzimas CTX- M. Por eso, cualquier estrategia encaminada a detectar la presencia de BLEEs se debería planificar evaluando, al menos, estos dos antibióticos (Jarlier et al., 1988; Cormican et al., 1996; Carter et al., 2000). Las BLEEs tipo SHV y TEM presentan resistencia de alto nivel a ceftazidima, mientras que las de tipo CTX-M confieren resistencia de alto nivel a cefotaxima (Oliver et al., 2001). Cefpodoxima es también un antibiótico muy sensible para detectar la presencia de BLEEs, por la alta capacidad hidrolítica de éstas sobre el mismo (Coudron et al., 1997; Thomson y Sanders, 1997). Muchos investigadores sugieren que los métodos, tanto de dilución como de difusión con disco, que utilizan cefpodoxima, detectan más BLEEs que si se usan otras cefalosporinas (Emery y Weywouth, 1997; Moland et al., 1998). Sin embargo, otros, sugieren que los ensayos de sensibilidad con cefpodoxima pueden dar lugar a un alto número de falsos positivos si se aplican los criterios del NCCLS, ya que este antibiótico también puede verse afectado por otros mecanismos de resistencia como la hiperproducción de una betalactamasa cromosómica AmpC, alteraciones de la permeabilidad, presencia de una betalactamasa K1 en K. oxytoca, producción de una enzima TEM-1 junto a pérdida o alteraciones de las porinas, o varios de estos mecanismos presentes en la misma bacteria. Todos ellos afectan más la CMI de cefpodoxima que la de cefotaxima o ceftazidima, pudiendo generar falsos positivos al valorar la presencia de BLEEs en bacterias como E. coli o Klebsiella spp. si sólo se usa cefpodoxima como cribado de estas enzimas (Oliver et al., 2002). Este ha sido el motivo por el que el NCCLS en el año 2002 modificó la CMI de 5. Discusión 313 cefpodoxima de ? 2 µg/ml a ? 8 µg/ml en los métodos de cribado para sospechar la presencia de BLEEs (tabla 19), pues los mecanismos anteriores pueden ser responsables de resistencias de bajo nivel. 5.1.1. Método A El 100% de los aislados clínicos de nuestro estudio productores de BLEEs presentaron diámetros del halo de inhibición del crecimiento alrededor del disco de cefpodoxima sola (CPD) ? 17 mm (media 7,0 y rango 6-17), y, en todos los casos, hubo un incremento superior a 5 mm en el halo de inhibición del disco que además contenía ácido clavulánico (CD01) (media 21,5 y rango 13-30), por tanto, cumplieron los criterios establecidos para este antibiótico (tablas 25 y 39). Hubo diferencias en el comportamiento de cefpodoxima según los aislados fuesen productores de CTX-M9 o de SHV (tablas 40 y 41). Entre los primeros los valores de media, desviación estándar y rango de los diámetros de inhibición del crecimiento alrededor de los discos de CPD y CD01 fueron inferiores respecto al grupo de productores de SHV, consecuencia de una mayor capacidad de hidrólisis de las enzimas CTX- M9 sobre cefpodoxima. Entre los aislados no productores de BLEEs cefpodoxima se mostró claramente por encima del valor límite de 17 mm (media 25,1 y rango 6-34), aunque hubo 24 aislamientos con diámetros alrededor del disco CPD < 17 mm, pero en ningún caso hubo incremento del diámetro en la asociación con ácido clavulánico (CD01) como puede verse por una media que apenas incrementa el valor de la cefalosporina sola (media 25,4 y rango 6-34) (tabla 42). Cefpodoxima se mostró, por tanto, como un antibiótico muy sensible para detectar BLEEs, tanto CTX-M9 como SHV, sin embargo, por sí solo, sin asociarse para ello a otras cefalosporinas, no es un método Betalactamasas de espectro extendido 314 válido, pues como se ha comentado, este antibiótico puede verse también afectado por otros mecanismos, pudiendo generar falsos positivos. Cefotaxima se mostró también, según nuestro estudio, como un antibiótico muy sensible para la detección de BLEEs. El 100% de los aislados productores de BLEEs presentaron diámetros del halo de inhibición del crecimiento alrededor del disco CTX < 27 mm (media 16,1 y rango 6-26), y en todos los casos hubo incremento superior a 5 mm en el diámetro alrededor del disco de cefotaxima más ácido clavulánico (CD03) (media 29,9 y rango 23-36), cumpliéndose los criterios establecidos para este antibiótico (tablas 25 y 39). El comportamiento de cefotaxima por este método fue similar para detectar aislados productores de CTX-M9 que para los productores de SHV (tablas 40 y 41). Entre los primeros la media de los diámetros de inhibición del crecimiento para CTX fue de 15,5 mm con un rango 8-22 mm y para CD03 la media fue 29,7 mm con un rango 24-36 mm, mientras que entre los aislados productores de SHV la media para CTX fue 16,8 mm y rango 6-26 mm y para CD03 la media fue 30,2 mm y rango 23-36 mm. Entre los aislados no productores de BLEEs cefotaxima se mostró claramente por encima del valor límite de 27 mm (media 32,2 y rango 25-40). Aunque hubo 16 aislamientos con diámetros alrededor del disco CTX < 27 mm, en ningún caso hubo incremento del diámetro en la asociación con ácido clavulánico (CD03) como puede verse por una media que incrementa poco el valor de la cefalosporina sola (media 33,3 y rango 26-40) (tabla 42). El comportamiento de ceftazidima, sin embargo, fue distinto comparado con las dos cefalosporinas anteriores. Aunque el diámetro medio alrededor del disco que sólo contenía ceftazidima (CAZ), entre los aislados productores de BLEEs, fue inferior a 22 mm (media 19,8 y rango 6-32) y hubo un incremento superior a 5 mm, con diámetro medio 5. Discusión 315 alrededor del disco con ácido clavulánico (CD02) de 28,8 mm (y rango 20-36) (tabla 39), el comportamiento de este antibiótico fue diferente en los aislados CTX-M9 y en los SHV. La media del diámetro alrededor del disco CAZ en los aislados CTX-M9 fue 24,5 mm (rango 12-32) (tabla 40), 17 aislados presentaron halos ? 22 mm, con incremento ? 5 mm en el disco que además contenía ácido clavulánico; mientras que 50 aislados presentaron diámetros > 22 mm, por lo que no fue valorable la sinergia con ácido clavulánico (tabla 25). En los aislados SHV la media del diámetro alrededor del disco CAZ fue 14,3 mm (rango 6-27), con un incremento superior a 5 mm cuando se asoció ácido clavulánico (CD02) (media 27,4 y rango 20-34) (tabla 41). Cuatro aislados presentaron diámetros alrededor del disco CAZ > 22 mm, no siendo valorable la sinergia con ácido clavulánico (tabla 25). Ninguno de estos 4 aislamientos fueron K. oxytoca, especie que podría presentar una enzima K1 hiperproducida con un perfil de resistencia a cefotaxima, cefpodoxima o aztreonam y sinergia en la combinación con ácido clavulánico, y sensibilidad a ceftazidima (Navarro et al., 2002). Este comportamiento se explica porque las enzimas CTX-M se caracterizan por conferir resistencia de alto nivel a cefuroxima, cefotaxima y cefepime, prácticamente sin incrementar las CMIs de ceftazidima, ya que la actividad hidrolítica frente a este último antibiótico es mínima en comparación con la de las otras cefalosporinas (Bradford, 2001). Así, en los microorganismos productores de BLEEs tipo CTX-M la utilización de ceftazidima y ceftazidima-ácido clavulánico como único substrato impedirá una detección correcta. Habitualmente la hidrólisis de este antibiótico por estas enzimas es muy pobre, al contrario de lo que acontece con la mayoría de las BLEEs del grupo SHV. Por el contrario, la hidrólisis de cefotaxima es muy eficiente por las CTX-M, siendo el mejor marcador para su detección. Esto podría explicar por qué algunos autores en estudios de aislados productores de enzimas SHV y TEM, Betalactamasas de espectro extendido 316 pero no de CTX-M, encuentran un rendimiento tan bajo a los métodos de detección de BLEEs basados en cefotaxima y cefotaxima con ácido clavulánico (Vercauteren et al., 1997; Ho et al., 1998; Hadziyannis et al., 2000) mientras que el rendimiento de esta combinación en nuestro estudio fue alto. 5.1.2. Método B El comportamiento de estos tres antibióticos (cefpodoxima, cefotaxima y ceftazidima) en el otro procedimiento de difusión con disco, método B, fue similar al método A (iguales medias, desviación estándar y rango para los diámetros alrededor del disco de la cefalosporina sola) (tablas 43 a 46). Cefpodoxima presentó diámetros ? 17 mm y un incremento del halo (sinergia) en la zona cercana al disco de amoxicilina-ácido clavulánico en el 100% de los aislados productores de BLEEs (tabla 47). Entre los 24 aislados no productores de BLEEs en los que el diámetro de CPD fue inferior a 17 mm, no se mostró sinergia en la zona cercana al ácido clavulánico. De la misma forma que en el método A, cefotaxima presentó halos reducidos e incremento del diámetro en la zona cercana al ácido clavulánico en el 100% de los aislados productores de BLEEs (tabla 47), mientras que ninguno de los 16 aislados no productores de BLEEs con diámetro inferior a 27 mm presentó sinergia con ácido clavulánico. Ceftazidima se comportó de forma distinta según los aislados fuesen CTX-M9 o SHV (tablas 44 y 45, respectivamente). Entre los primeros, 17 aislados presentaron diámetros ? 22 mm alrededor del disco CAZ y sinergia en la zona cercana al ácido clavulánico, mientras que 50 tenían halos > 22 mm; entre los segundos, 4 aislados poseían diámetros alrededor del disco CAZ > 22 mm, no siendo valorable la sinergia (tabla 5. Discusión 317 47). Estos aislados, que presentaron discordancia entre los resultados obtenidos para ceftazidima y la presencia de una BLEE, fueron los mismos en los métodos A y B. Así, por tanto, ceftazidima detectó el 56,8% (71/125) de los aislados productores de BLEEs. Aztreonam tuvo también un comportamiento variable. En líneas generales se mostró útil para detectar los aislados productores de BLEEs, con diámetros de inhibición del crecimiento alrededor del disco ATM ?27 mm (media 20,1 y rango 6-32) (tabla 43) y sinergia en la zona adyacente al ácido clavulánico en 50 aislados CTX-M9 y 53 aislados SHV (tabla 47), cumpliéndose los criterios establecidos para este antibiótico (tabla 25) en el 82,4% (103/125) de los aislados productores de BLEEs. Hubo diámetros inferiores a 27 mm pero sin sinergia con ácido clavulánico en 7 CTX-M9 y 4 SHV; y por último, en 10 CTX-M9 y 1 aislado SHV los diámetros alrededor del disco ATM fueron superiores a 27 mm, no siendo valorable la sinergia (tabla 47). Entre los aislados no productores de BLEEs aztreonam se mostró claramente por encima del valor límite de 27 mm (media 32,9 y rango 25-43) (tabla 46), aunque hubo 28 aislamientos con diámetros alrededor del disco ATM inferiores a 27 mm pero en ningún caso hubo sinergia en la asociación con ácido clavulánico. En definitiva, en nuestro medio es imprescindible utilizar cefotaxima y ceftazidima, solos y en combinación con ácido clavulánico (bien sea en discos independientes o con un disco de amoxicilina-ácido clavulánico como fuente de ácido clavulánico), como los dos antibióticos de elección en cualquier método de difusión con disco que se utilice con la finalidad de identificar aislados productores de BLEEs. El uso de discos de cefpodoxima y aztreonam solos y en combinación con ácido clavulánico no aportan, necesariamente, mayor capacidad de detección de BLEEs en nuestro medio. Ahora bien, la elevada resistencia que expresarían aislados poseedores del enzima K1 de K. oxytoca a Betalactamasas de espectro extendido 318 cefotaxima, cefpodoxima y sobretodo, a aztreonam, la sinergia de éstos con ácido clavulánico y la sensibilidad a ceftazidima, puede convertir la interpretación de los resultados de aztreonam en necesarios para distinguir esta enzima de una posible producción de BLEEs (Navarro et al., 2002). 5.1.3. Difusión con disco con cefepime y cefoxitina Aunque no es un criterio NCCLS, cefepime y cefoxitina fueron dos antibióticos ensayados mediante difusión con disco para determinar la posible coexistencia, en los aislados clínicos, de producción de BLEEs y presencia de betalactamasas no inducibles AmpC o mecanismos de impermeabilidad, siguiendo las directrices expuestas en el apartado 3.2.1. Entre los 125 aislados que se clasificaron por el método A como productores de una BLEE, se pudo determinar (tabla 53): ? 105 aislados fueron sensibles para cefepime (diámetro del halo de inhibición ? 18 mm) y para cefoxitina (diámetro del halo de inhibición ? 18 mm). Se consideró que estos aislados sólo expresaban una BLEE. ? 13 aislados fueron resistentes para cefepime (diámetro del halo de inhibición < 18 mm) y éste presentaba sinergia con ácido clavulánico; además fueron sensibles para cefoxitina. Se consideró que estos aislados sólo expresaban una BLEE. ? 4 aislados fueron resistentes para cefepime y éste presentaba sinergia con ácido clavulánico; además fueron resistentes para cefoxitina (diámetro del halo de inhibición < 18 mm). Se consideró que estos aislados además de expresar una BLEE, podrían presentar una alteración de la permeabilidad o una betalactamasa AmpC. ? 3 aislados fueron sensibles para cefepime y resistentes para cefoxitina. También se consideró que estos aislados además de 5. Discusión 319 expresar una BLEE, podrían presentar una alteración de la permeabilidad o una betalactamasa AmpC. La resistencia a cefoxitina en aislados productores de BLEEs (que, en principio, son sensibles a cefoxitina) no diferencia entre organismos productores de AmpC y otros mecanismos de resistencia como las alteraciones de la permeabilidad (Steward et al., 2001). Entre los 344 aislados clínicos que no poseían un fenotipo compatible con la presencia de BLEEs 284 fueron sensibles tanto a cefepime como a cefoxitina y 60 fueron sensibles a cefepime y resistentes a cefoxitina. En ninguno de los 344 aislados hubo sinergia de cefepime con ácido clavulánico. 5.2. Estudio bioquímico y molecular de los aislados productores de BLEEs Una vez que los dos grupos estuvieron definidos en función de los resultados obtenidos por el método de referencia, se realizó estudio bioquímico, mediante isoelectroenfoque, y estudio molecular, mediante PCR, de los 125 aislados que fenotípicamente expresaron la producción de una betalactamasa de espectro extendido, tal como se describen en los apartados 3.3.1. y 3.3.2. respectivamente. En cada caso se decidió qué técnica de PCR realizar según el estudio fenotípico (menor o mayor capacidad de hidrólisis de ceftazidima y cefotaxima) y del resultado de pI obtenido por isoelectroenfoque, pues cada BLEE posee un punto isoeléctrico definido (tablas 3, 6 y 8). A los 23 aislamientos de la especie E. coli que poseían exclusivamente una betalactamasa de punto isoeléctrico 8.1 se les realizó Betalactamasas de espectro extendido 320 PCR para las enzimas CTX-M9 y CTX-M10. Todas ellas fueron positivas a CTX-M9. A los 44 aislados de E. coli con pI 8.1 y 5.4 también se les realizó PCR para las enzimas CTX-M9 y CTX-M10, siendo positivo el resultado en todos ellos a la presencia de CTX-M9. Se consideró que el punto isoeléctrico 5.4 es compatible en esta especie bacteriana con la presencia de una betalactamasa plasmídica clásica tipo TEM-1. Así, se obtuvieron 67 aislados productores de CTX-M9 (54% del total), todos ellos de la especie E. coli (tabla 32 y figura 31). A los 9 aislados de E. coli, 1 de K. pneumoniae y 2 de K. oxytoca que presentaron por isoelectroenfoque un pI 8.2 se les realizó PCR genérica para enzimas SHV, siendo en los 12 casos positiva. A los 39 aislados de E. coli con pI 8.2 y 5.4 se les realizó PCR genérica para enzimas SHV, siendo positiva en todos los casos. Se consideró que el punto isoeléctrico 5.4 es compatible en esta especie bacteriana con la presencia de una betalactamasa plasmídica clásica tipo TEM-1. A los 7 aislados de K. pneumoniae con pI 8.2 y 7.6 se les realizó PCR genérica para enzimas SHV, siendo positiva en todos los casos. Se consideró que el punto isoeléctrico 7.6 es compatible en esta especie bacteriana con la presencia de una betalactamasa plasmídica clásica tipo SHV-1. Así, se obtuvieron 58 aislados productores de SHV, (46% del total), de las especies E. coli (83%), K. pneumoniae (14%) y K. oxytoca (3%). No se pudo determinar qué BLEE tipo SHV poseían, aunque un pI 8.2 es compatible con SHV-5, SHV-9, SHV-10, SHV-12, y SHV-45 (tabla 6). 5. Discusión 321 5.3. Prueba de Epsilon La prueba de difusión en gradiente o E-test permite solventar la limitación de las técnicas de difusión con disco para obtener directamente valores de CMI. Muchos estudios han demostrado la fiabilidad y la reproducibilidad del E-test, que ofrece, en general, resultados similares a los obtenidos con un método estandarizado de dilución (Jones, 2001). Siguiendo las normas de detección de BLEEs según la prueba de Epsilon (apartado 3.2.2.), el E-test CT/CTL fue capaz de detectar la producción de BLEEs en los 125 aislados. En todos los casos, el cociente entre la CMI de cefotaxima sola (CT) y de cefotaxima con ácido clavulánico (CTL) fue ? 8 (? 3 diluciones) (tabla 26 y figura 71). Sesenta y seis aislados productores de CTX-M9 presentaron una CMI de cefotaxima ? 2 µg/ml, y sólo 1 aislado CTX-M9 tuvo una CMI inferior (1 µg/ml), pero en todos los casos la reducción en presencia de ácido clavulánico fue ? 3 diluciones (figura 50). De los 58 aislados productores de SHV, 37 poseían una CMI ? 2 µg/ml y 21 la presentaban inferior, pero en todos los casos hubo una reducción ? 3 diluciones en la asociación con ácido clavulánico (figura 50). Sin embargo, el E-test TZ/TZL no fue capaz, por sí solo, de detectar la presencia de BLEEs en todos los casos. El cociente entre la CMI de ceftazidima sola (TZ) y en combinación con ácido clavulánico (TZL) fue ? 8 (? 3 diluciones) en 14 aislados productores de CTX-M9 (21%) (figura 72) y en 50 de los aislados productores de SHV (86%) (figura 74), es decir, en el 51% del total de aislados productores de BLEEs (figura 70). En el resto de aislados productores de BLEEs el cociente fue inferior a 3 diluciones (44%) o indeterminado (5%) (figura 70). Sólo 5 aislados productores de CTX-M9 presentaron CMIs de ceftazidima ? 2 µg/ml; para los 62 aislados restantes fueron inferiores Betalactamasas de espectro extendido 322 (figura 46). Cuarenta y seis aislados productores de SHV poseían una CMI de ceftazidima ? 2 µg/ml, mientras que los restantes 12 presentaban una CMI inferior (figura 46). Si analizamos los resultados de CMI 50 y CMI 90 para ceftazidima obtenidos mediante el método Epsilon, podemos observar que las concentraciones de ceftazidima que inhiben el 50% (CMI 50 ) y el 90% (CMI 90 ) de los aislados productores de CTX-M9 son muy inferiores a los valores que para estos parámetros presenta el mismo antibiótico en los aislados productores de SHV (tablas 55 y 56), es decir, la CMI de ceftazidima en los aislados CTX-M9 se movió en valores muy bajos respecto a los aislados SHV, consecuencia de la menor capacidad de hidrólisis de las enzimas CTX-M por ceftazidima (Bradford, 2001). Estos resultados son acordes con los mostrados po la prueba de Kruskal-Wallis. Sin embargo, si analizamos los resultados de CMI 50 y CMI 90 para cefotaxima obtenidos mediante el método Epsilon, podemos observar que las concentraciones de cefotaxima que inhiben el 50% (CMI 50 ) y el 90% (CMI 90 ) de los aislados productores de CTX-M9 fueron algo superiores a los valores que para estos parámetros presentó el mismo antibiótico en los aislados productores de SHV (tablas 55 y 56), es decir, la CMI de cefotaxima en los aislados CTX-M9 se movió en valores similares a los aislados SHV (ligeramente superior la CMI 50 para los aislados CTX-M9, por una mayor capacidad de hidrólisis de estas enzimas por cefotaxima) (Bradford, 2001). También estos resultdos son acordes con los obtenidos mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Los aislados no productores de BLEEs fueron sensibles a las cefalosporinas ensayadas, con CMIs < 2 µg/ml, a excepción de 4 aislados con CMI = 12 µg/ml para TZ (resistentes) y 8 aislados con CMI = 2 µg/ml para CT (sensibles, pero en el punto de corte según el NCCLS para sospechar una BLEE) (figuras 47 y 49), y en ningún caso hubo reducción 5. Discusión 323 ?3 diluciones de la CMI de las cefalosporinas solas cuando se añadió ácido clavulánico (figuras 76 y 77). Por tanto, al igual que en los métodos de difusión con disco, el E- test de ceftazidima, por sí solo, no es capaz de identificar la presencia de BLEEs debido a la baja capacidad de hidrólisis de las enzimas CTX-M9, fundamentalmente, para este antibiótico, como ha quedado demostrado. Aunque el E-test de cefotaxima sí detectó el 100% de las BLEEs de nuestro estudio, no podemos decir que el uso exclusivo de este E-test pueda detectar la presencia de todos los tipos de BLEEs (incluyendo BLEEs tipo TEM, que nosotros no encontramos) y pensamos que siempre deben usarse conjuntamente para este fin. Como ningún aislado presentó CMIs superiores a los límites superiores de detección de los E-test TZ/TZL y CT/CTL, no hubo indicación de realizar E-test con cefepime (PM/PML). 5.4. Resultados obtenidos mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos betalactámicos A los 469 aislados se les realizó estudio de sensibilidad mediante el sistema VITEK 2 como se describe en el apartado 3.2.3.1. Como la selección de especies bacterianas se había realizado previamente a través de pruebas bioquímicas usando el sistema Api20E, la identificación de especie se introdujo manualmente en el sistema VITEK 2 y éste aportó el estudio de sensibilidad del microorganismo inoculado en las tarjetas AST-N020 tras ensayar las distintas concentraciones de antibióticos para cada aislado (tabla 21). El sistema VITEK 2 emitió un informe para cada aislado clínico donde constaban la identificación de especie, las CMIs obtenidas in vitro para cada antibiótico ensayado, la categoría clínica correspondiente (sensible, intermedio o resistente) según el resultado obtenido para cada antibiótico, la categoría clínica para antibióticos no Betalactamasas de espectro extendido 324 ensayados pero inferidos, la modificación de las CMIs y/o de las categorías clínicas obtenidas in vitro una vez que el sistema AES realizó la interpretación del fenotipo de resistencia obtenido para cada grupo de antibióticos, y un informe con los fenotipos de resistencia obtenidos según la valoración del sistema AES. Los 125 aislados productores de BLEEs según el método fenotípico de referencia fueron reconocidos también por el sistema VITEK 2, que informó en todos los casos la posible presencia de una BLEE y modificó, como veremos, los resultados del estudio de sensibilidad in vitro de los antibióticos betalactámicos afectados por la presencia de estas enzimas. De los 344 aislados no productores de BLEEs según el método de referencia, el VITEK 2 informó posible presencia de BLEEs en 16, mientras que en 328 aislados no informó, por el fenotipo encontrado, dicha presencia. 5.4.1. Concentración mínima inhibitoria in vitro en los antibióticos betalactámicos Analizando los resultados in vitro obtenidos para los distintos antibióticos betalactámicos ensayados mediante el sistema VITEK 2 se pudo observar que: Aunque el 100% de los aislados que poseían una BLEE tenían una CMI de ampicilina ? 32 µg/ml (figura 78), y hubo un 18% de los aislados no productores de BLEEs que presentaron unas CMIs de ampicilina en rangos de sensibilidad (? 8 µg/ml) (figura 114), ésta se mostró con CMIs elevadas tanto en el grupo de aislados productores de BLEEs como en el de los no productores (en todos los grupos de estudio CMI 50 y CMI 90 fueron ? 32 µg/ml) (tablas 58 a 61). No hubo diferencias 5. Discusión 325 significativas entre los aislados productores de CTX-M9 y los productores de SHV. En el grupo de aislados no productores de BLEEs la resistencia a ampicilina se debe a que, en estas especies bacterianas, son frecuentes los mecanismos de resistencia distintos a la presencia de una BLEE que acaban afectando a este antibiótico (betalactamasa AmpC hiperproducida, betalactamasas plasmídicas clásicas o enzima K1) (Navarro et al., 2002). Es, por tanto, uno de los antibióticos que más se afectan por los distintos mecanismos de resistencia frente a antibióticos betalactámicos. Amoxicilina-ácido clavulánico presentó una CMI 50 = 4/2 µg/ml en los dos grupos de aislados y una CMI 90 = 16/8 µg/ml entre los productores de BLEEs y ? 32/16 µg/ml entre los no productores, es decir, hubo significativamente más resistencia en el segundo grupo. No hubo diferencias significativas entre los aislados productores de CTX-M9 y los productores de SHV. La presencia de ácido clavulánico en esta combinación antibiótica hace disminuir considerablemente las CMIs de ampicilina sola puesto que las BLEEs son enzimas inhibidas por los inhibidores de betalactamasas. Es muy importante determinar cual es la CMI de este antibiótico, pues en el tratamiento de una ITU no complicada, en un paciente extrahospitalario, por un microorganismo portador de una BLEE (representan el 18,8% de las 469 muestras de nuestro estudio y el 70,4% de los aislados productores de BLEEs), amoxicilina-ácido clavulánico podría ser una buena opción terapéutica, siempre y cuando se muestre con CMIs bajas y en el rango de sensibilidad (Spanu et al., 2002; Oliver y Cantón, 2004). En cualquier caso, el comportamiento de esta combinación de antibióticos ante la presencia de una BLEE es variable, pudiéndose mostrar activo o no, según el caso; pero la coexistencia en el mismo microorganismo de una enzima AmpC (E. coli) o SHV-1 (K. pneumoniae) hiperproducidas y la Betalactamasas de espectro extendido 326 enzima BLEE, hará que la combinación amoxicilina-ácido clavulánico se muestre poco activa (Navarro et al., 2002). Por las mismas razones que ampicilina (Navarro et al., 2002), piperacilina se mostró con CMIs elevadas en ambos grupos de estudio (CMI 50 ? 128 µg/ml en los aislados productores de BLEEs y CMI 50 = 16 µg/ml en los no productores, y CMI 90 ? 128 µg/ml en ambos grupos). Sin embargo, la distribución de las CMIs no fue igual, el 97% de los aislados productores de BLEEs tuvieron CMIs > 16 µg/ml (resistentes a piperacilina) mientras que en el otro grupo dicho porcentaje fue del 44% (figuras 80 y 116). No hubo diferencias significativas entre los aislados productores de CTX-M9 y los productores de SHV. Piperacilina-tazobactam, como amoxicilina-ácido clavulánico, mostró CMIs iguales en los dos grupos (CMI 50 ? 4/4 µg/ml y CMI 90 = 8/4 µg/ml), ambos resultados en el rango de sensibilidad para este antibiótico por tratarse de una combinación con un inhibidor de betalactamasas. No hubo diferencias significativas entre el grupo de aislados productores de BLEEs y el grupo de no productores, ni entre el grupo de productores de CTX-M9 y los productores de SHV. Hay que apreciar que entre los aislados productores de CTX-M9 (tabla 59) la CMI 90 de piperacilina-tazobactam fue ? 4/4 µg/ml, la más baja de los cuatro grupos. Esto es así porque una característica importante de las enzimas CTX-M es que son inhibidas mejor por tazobactam que por sulbactam o ácido clavulánico (Tzouvelekis et al., 2000). Este antibiótico, según algunos autores, es una buena opción terapéutica a nivel hospitalario para pacientes con infecciones sistémicas por microorganismos productores de BLEEs, siempre y cuando presente CMIs dentro del rango de sensibilidad (Spanu et al., 2002; Oliver y Cantón, 2004); otros, sin embargo, no aconsejan su uso por haberse producido fracasos terapéuticos (Johnson et al., 2002). 5. Discusión 327 Cefalotina fue poco activa tanto en los aislados productores de BLEEs como en los no productores (CMI 50 ? 64 µg/ml en los aislados productores de BLEEs, CMI 50 = 16 µg/ml en los no productores y CMI 90 ? 64 µg/ml en ambos grupos) (tablas 58 y 61), explicable por las mismas razones que lo fueron ampicilina y piperacilina (Navarro et al., 2002). Pero al igual que ampicilina, mientras que el 100% de los aislados productores de BLEEs presentaban CMIs de cefalotina ? 64 µg/ml, sólo el 22% de los aislados no productores hacían lo mismo (figuras 82 y 118). No hubo diferencias significativas entre los aislados productores de CTX-M9 y los productores de SHV. Cefuroxima presentó CMIs elevadas en el grupo de aislados productores de BLEEs (CMI 50 y CMI 90 ? 64 µg/ml) como corresponde a la hidrólisis por estas enzimas de una cefalosporina de segunda generación. Pero al contrario de lo que ocurría con ampicilina, piperacilina y cefalotina, entre los aislados no productores de BLEEs este antibiótico se mostró significativamente más activo (CMI 50 = 4 µg/ml y CMI 90 = 32 µg/ml) ya que es más activo que penicilinas y cefalosporinas de primera generación frente a betalactamasas clásicas (Navarro et al., 2002). Además, las enzimas CTX-M confieren resistencia de alto nivel no sólo a cefotaxima sino también a cefuroxima (Bradford, 2001) y eso explica una mayor CMI 50 en el grupo de productores de CTX-M9 respecto a los de SHV, consecuencia de una distribución significativamente distinta de las CMIs entre ambos grupos (figuras 95 y 107). Cefoxitina, in vitro, es un antibiótico que se muestra activo frente a las BLEEs, salvo que coexistan en el mismo aislado la presencia de estas enzimas con alteraciones de la permeabilidad, cefamicinasas o betalactamasas AmpC hiperproducidas, en cuyo caso, existirá resistencia a cefoxitina por estos mecanismos (Navarro et al., 2002). Cuando la CMI Betalactamasas de espectro extendido 328 de cefoxitina detectada por el VITEK 2 fue ? 8 µg/ml entre los aislados productores de BLEEs (85%), en su informe sobre mecanismos de resistencia a betalactámicos sólo informó posible presencia de BLEEs. Sin embargo, cuando la CMI para este antibiótico fue ? 16 µg/ml (15%), informó no sólo la posible presencia de BLEEs, sino también la asociación probable con mecanismos de impermeabilidad que modificasen la CMI que cabría esperar si sólo existiese una BLEE. Cefoxitina presentó diferencias entre los dos grupos de estudio, mostrándose significativamente más activa en el grupo de aislados productores de BLEEs (CMI 50 ? 4 µg/ml en ambos grupos de aislados, CMI 90 = 16 µg/ml entre los productores y CMI 90 = 32 µg/ml entre los no productores) (tablas 58 y 61). No hubo diferencias significativas entre los aislados productores de CTX-M9 y los productores de SHV. Las CMIs observadas para cefotaxima fueron significativamente diferentes entre el grupo de aislados productores de BLEEs y el de no productores (tablas 58 y 61). En el primero, la CMI 50 fue de 8 µg/ml y la CMI 90 fue ? 64 µg/ml. Entre los aislados no productores de BLEEs cefotaxima se mostró claramente activa, con CMI 50 y CMI 90 ? 1 µg/ml (el 100% de los aislados poseían una CMI ? 8 µg/ml). Estos resultados fueron resultados in vitro, es decir, anteriores a las correcciones que el sistema AES realizó una vez determinado que el mecanismo de resistencia presente era la producción de una enzima BLEE, por esa razón, algunas CMIs que mostraron sensibilidad, posteriormente se corrigieron a resistentes. Si analizamos los resultados en los grupos productores de CTX-M9 y SHV (significativamente diferentes entre sí), observamos que las menores CMIs que presentó cefotaxima entre los aislados productores de BLEEs se producen a expensas de CMIs menores entre los aislados que poseían enzimas SHV (CMI 50 = 16 µg/ml entre los CTX-M9 frente a CMI 50 = 8 µg/ml entre los SHV), puesto que 5. Discusión 329 cefotaxima es mejor hidrolizada por las enzimas CTX-M9 que por las SHV, explicando esta diferencia de CMIs (Bradford, 2001). Cefpodoxima fue, de las tres cefalosporinas de tercera generación ensayadas por el sistema VITEK 2, la única en la que la concentración que inhibía el 50% de los aislados productores de BLEEs y la concentración que inhibía el 90%, fue la misma, e igual para los dos grupos, productores de CTX-M9 y productores de SHV (CMI 50 y CMI 90 ? 8 µg/ml) (tablas 59 y 60), ya que el 97% de estos aislados poseían una CMI de cefpodoxima ? 8 µg/ml (figura 86). Esta cefalosporina se mostró activa en el conjunto de aislados no productores de BLEEs (CMI 50 ? 2 µg/ml y CMI 90 = 2 µg/ml) (tabla 61). Al igual que las dos cefalosporinas de tercera generación anteriores, ceftazidima presentó diferencias significativas en el estudio de sensibilidad mediante el sistema VITEK 2 entre los aislados productores y no productores de BLEEs. Como en los casos anteriores, los aislados no productores de BLEEs se mostraron claramente sensibles a ceftazidima (CMI 50 y CMI 90 ? 1 µg/ml), con el 100% de los aislados con CMI ? 4 µg/ml, mientras que los aislados productores fueron resistentes. Entre estos últimos podemos ver diferencias significativas en el comportamiento in vitro de este antibiótico entre el grupo de los productores de CTX-M9 y los que poseyeron una enzima SHV. Como es propio de la menor capacidad hidrolítica de las enzimas CTX-M9 sobre este antibiótico (Bradford, 2001), las CMIs obtenidas en este grupo son significativamente inferiores, y en el rango de sensibilidad, respecto a las obtenidas entre los aislamientos productores de SHV (CMI 50 ? 1 µg/ml frente a CMI 50 = 16 µg/ml, y CMI 90 = 2 µg/ml frente a CMI 90 ? 64 µg/ml, respectivamente) (tablas 59 y 60). La posterior modificación por el sistema AES de los resultados in vitro para este antibiótico hizo que el resultado para ceftazidima se emitiese como resistente en todos los Betalactamasas de espectro extendido 330 aislados productores de BLEEs. Esta modificación se realizó en 58 aislados productores de CTX-M9 y 9 aislados productores de SHV. Este resultado obtenido para ceftazidima mediante el sistema VITEK 2 es acorde con los obtenidos por los procedimientos de difusión con disco y E-test. Cefepime, la única cefalosporina de cuarta generación probada por el sistema VITEK 2, se mostró activa, in vitro, tanto en el grupo de aislados productores de BLEEs como en el de no productores (tablas 58 y 61), aunque las CMIs en este segundo grupo fueron significativamente inferiores respecto al primero (100% de los aislados no productores de BLEEs con CMI ? 1 µg/ml) (figuras 88 y 124). Hubo diferencias significativas entre los grupos de aislados productores de CTX-M9 y el de SHV en cuanto a la distribución de las CMIs de cefepime, pero no las hubo cuando se analizaron las categorías clínicas en ambos grupos para este antibiótico: hubo una distribución de CMIs más elevadas en el grupo de aislados productores de enzimas CTX-M9 (el 94% de los aislados productores de CTX-M9 poseían una CMI ? 8 µg/ml, mientras que en el grupo de productores de SHV este porcentaje fue del 98%), como corresponde a una mayor capacidad de hidrólisis de estas enzimas sobre este antibiótico. La capacidad hidrolítica de las enzimas tipo BLEE sobre este antibiótico es variable (Navarro et al., 2002), sin embargo se desaconseja su uso terapéutico por haberse descrito fracasos (Paterson et al., 2001b), por esa razón, el sistema AES informó resistencia a cefepime en el informe definitivo. Meropenem fue el único antibiótico betalactámico ensayado por el sistema VITEK 2 que se mostró activo, y con CMIs muy bajas (CMI ? 0,25 µg/ml) en el 100% de los aislados tanto productores como no productores de BLEEs. Según estos resultados, meropenem, y por extensión los carbapenémicos, se convierten, en principio, en la mejor 5. Discusión 331 opción terapéutica entre los antibióticos betalactámicos para el tratamiento de microorganismos productores de BLEEs. 5.4.2. Categorías clínicas para los antibióticos betalactámicos Cuando el sistema VITEK 2 analiza los resultados de sensibilidad obtenidos in vitro para los distintos antibióticos es capaz de inferir qué mecanismo de resistencia, si lo hay, puede explicar ese comportamiento fenotípico, y modificar las CMIs y/o las categorías clínicas obtenidas para un antibiótico si el resultado no es coherente con el mecanismo de resistencia inferido para esa especie bacteriana, modificando siempre de sensible a resistente el ensayo. Por esta razón, cuando el sistema VITEK 2 identifica una posible producción de BLEEs modifica las categorías clínicas de sensible a resistentes de todas las penicilinas, cefalosporinas de primera, segunda, tercera y cuarta generación, e incluso, infiere resultados no ensayados, como resistencia a aztreonam, pero no modifica los resultados obtenidos para las combinaciones de betalactámicos con inhibidores de betalactamasas, para cefoxitina, ni para carbapenémicos. En las tablas 62 a 69 y en las figuras 126 a 133 quedan reflejadas las modificaciones que el sistema AES realizó de las categorías clínicas en los antibióticos betalactámicos ensayados. Así, los resultados in vitro para amoxicilina y cefalotina fueron, en los 125 aislados productores de BLEEs, resistentes, y se informaron como tales, por lo que el sistema AES no tuvo que hacer ninguna modificación. No se modificaron los resultados obtenidos in vitro para amoxicilina-ácido clavulánico, piperacilina-tazobactam, cefoxitina ni meropenem. Piperacilina, cefuroxima, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima y cefepime fueron informados como resistentes tras las Betalactamasas de espectro extendido 332 correcciones que el sistema AES realizó en aquellos aislados que presentaron CMIs dentro del rango de sensibilidad. 5.5. Resultados obtenidos mediante el sistema VITEK 2 para los antibióticos no betalactámicos Considerando que el sistema VITEK 2 demostró mejor capacidad para detectar enzimas tipo BLEEs en nuestro medio, el estudio de la posible asociación de resistencias en otros grupos antibióticos (aminoglucósidos, quinolonas, nitrofurantoína y cotrimoxazol) se realizó a partir de los resultados obtenidos para éstos en los 469 aislados estudiados mediante este sistema automatizado. Amikacina se mostró activa tanto en el grupo de aislados productores de BLEEs (CMI 50 y CMI 90 ? 2 µg/ml) como en el de no productores, aunque la distribución de CMIs mostró en este segundo grupo valores ligeramente más elevados (CMI 50 ? 2 µg/ml y CMI 90 = 4 µg/ml) (tablas 70 y 73). Aunque los valores de CMI 50 y CMI 90 fueron iguales entre sí en los grupos de aislados productores de CTX-M9 y SHV (? 2 µg/ml), sin embargo, el 100% de los aislados productores de CTX- M9 tenían CMIs ? 2 µg/ml mientras que en el grupo de productores de SHV fue del 91%, es decir, en este segundo grupo hubo mayor proporción de CMIs elevadas (figuras 142 y 150). Gentamicina también se mostró activa, tanto en el grupo de aislados productores de BLEEs, con un 84% de aislamientos con CMIs ? 4 µg/ml, como en el de no productores, con un 83% (CMI 50 ? 1 µg/ml y CMI 90 ? 16 µg/ml en ambos grupos) (tablas 70 y 73). Por su parte, presentó CMIs más elevadas en el grupo de aislados productores de enzimas SHV (CMI 50 ? 1 µg/ml y CMI 90 ? 16 µg/ml) que en el de 5. Discusión 333 productores de CTX-M9 (CMI 50 ? 1 µg/ml y CMI 90 = 4 µg/ml) (tablas 71 y 72). Tobramicina fue activa, tanto en el grupo de aislados productores de BLEEs, con un 84% de aislamientos con CMIs ? 4 µg/ml, como en el de no productores, con un 85% (CMI 50 ? 1 µg/ml y CMI 90 = 8 µg/ml en ambos grupos). Sin embargo, presentó CMIs más elevadas en el grupo de aislados productores de enzimas SHV (CMI 50 ? 1 µg/ml y CMI 90 ? 16 µg/ml) que en el de productores de CTX-M9 (CMI 50 ? 1 µg/ml y CMI 90 = 2 µg/ml). Ciprofloxacino se mostró significativamente menos activo en el grupo de aislados productores de BLEEs (CMI 50 ? 4 µg/ml y CMI 90 ? 4 µg/ml), con un 33% de los aislados con CMIs ? 1 µg/ml (figura 137), que en el de no productores (CMI 50 = 1 µg/ml y CMI 90 ? 4 µg/ml), con un 56% de los aislados con CMIs ? 1 µg/ml (figura 161). Aunque los valores de CMI 50 y CMI 90 fueron iguales entre sí en los grupos de aislados productores de CTX-M9 y SHV (? 4 µg/ml), sin embargo, el 26% de los aislados productores de CTX-M9 tuvieron CMIs ? 1 µg/ml (figura 145), mientras que en el grupo de productores de SHV eran el 38% (figura 153), es decir, en el primer grupo hubo mayor proporción de CMIs elevadas. Norfloxacino también se mostró significativamente menos activo en el grupo de aislados productores de BLEEs (CMI 50 ? 16 µg/ml y CMI 90 ? 16 µg/ml), con un 35% de los aislados con CMIs ? 4 µg/ml, que en el de no productores (CMI 50 = 2 µg/ml y CMI 90 ? 16 µg/ml), con un 57% de los aislados con CMIs ? 4 µg/ml. No hubo diferencias significativas para este antibiótico entre los grupos de aislados productores de CTX-M9 y SHV. Y por último, entre las quinolonas, ofloxacino se mostró significativamente menos activo en el grupo de aislados productores de Betalactamasas de espectro extendido 334 BLEEs (CMI 50 ? 8 µg/ml y CMI 90 ? 8 µg/ml), con un 31% de los aislados con CMIs ? 2 µg/ml, que en el de no productores (CMI 50 = 2 µg/ml y CMI 90 ? 8 µg/ml), con un 55% de los aislados con CMIs ? 2 µg/ml. No hubo diferencias significativas para este antibiótico entre los grupos de aislados productores de CTX-M9 y SHV. Aunque nitrofurantoína no presentó diferencias significativas en cuanto a las categorías clínicas de sensible y resistente entre el grupo de aislados productores de BLEEs y el de no productores, sí aparecían indicios de significación ya que presentó CMIs más elevadas en el grupo de aislados productores de BLEEs (70% de aislados con CMIs ? 32 µg/ml en el grupo de aislados productores de BLEEs, frente a 79% en el grupo de aislados no productores) (figuras 140 y 164, respectivamente). No hubo diferencias significativas para este antibiótico entre los grupos de aislados productores de CTX-M9 y SHV. También hubo indicios de significación entre el grupo de aislados productores de BLEEs y el de no productores en cuanto a la sensibilidad a trimetoprim-sulfametoxazol, ya que las CMIs fueron más elevadas en el grupo de aislados productores de BLEEs (CMI 50 y CMI 90 ? 320 µg/ml) que en el de no productores (CMI 50 ? 20 µg/ml y CMI 90 ? 320 µg/ml) (tablas 70 y 73). De la misma forma, hubo diferencias significativas entre los aislados productores de CTX-M9 que se mostraron más resistentes (CMI 50 y CMI 90 ? 320 µg/ml) que los productores de SHV (CMI 50 ? 20 µg/ml y CMI 90 ? 320 µg/ml) (tablas 71 y 72). En relación a los datos anteriores se sabe que: Fernández-Rodríguez et al. (1992b) encontraron un 84% de aislados productores de BLEEs resistentes a gentamicina, siendo el mecanismo más frecuentemente asociado la presencia de las enzimas AAC(3)V, APH(3?) y APH(3?)I. 5. Discusión 335 Hadziyannis et al. (2000) no encontraron asociación entre presencia de BLEEs y resistencia a gentamicina ni cotrimoxazol. La presencia de resistencias a tobramicina, gentamicina, tetraciclinas y cotrimoxazol, asociadas a la producción de BLEEs, fueron muy frecuentes en el estudio realizado por Winokur et al. (2001), con una distribución importante en las distintas áreas del estudio. Casi el 85% de los aislados de K. pneumoniae en Latinoamérica y el 81% de los aislados europeos mostraron resistencia a tobramicina. En general, la resistencia a amikacina fue menor que a tobramicina y a gentamicina. La co-resistencia a ciprofloxacino fue desde 14% a 80%, particularmente con niveles altos de resistencia a quinolonas en los aislados de P. mirabilis. En el trabajo de Lautenbach et al. (2001b) el 55,8% de los aislados de E. coli y K. pneumoniae productores de BLEEs fueron resistentes a fluorquinolonas. Otros resultados de resistencias presentes en estos aislados fueron: amikacina 43,5%, gentamicina 27%, tobramicina 24,4%, tetraciclinas 32,5%, y cotrimoxazol 19,6%. La resistencia a fluorquinolonas en aislados clínicos productores de BLEEs fue más frecuente entre los pacientes que habían recibido fluorquinolonas o aminoglucósidos en los 30 días previos a la infección y en aquellos que procedían de una residencia (por una posible transmisión horizontal, aunque no se realizó estudio de clonalidad). En otros estudios, como el realizado en Turquía por Tolun et al. (2004) encontraron más asociación de resistencias entre BLEEs y ciprofloxacino en la especie E. coli (p=0,015) que en la especie K. pneumoniae (p=0,276). La frecuencia de resistencia a fluorquinolonas ha alcanzado ya niveles preocupantes, especialmente en E. coli. Hay una tendencia en España al aumento del consumo de fluorquinolonas, principalmente fuera del hospital, que ha hecho que la resistencia a éstos en E. coli adquiridos Betalactamasas de espectro extendido 336 en la comunidad haya aumentado significativamente en los últimos años (Lázaro et al., 2004). En general, se observa una asociación significativa entre la producción de BLEEs y la resistencia a estos antibióticos, especialmente en aislados de E. coli causantes de infección del tracto urinario en la comunidad. Puesto que la resistencia a fluorquinolonas en enterobacterias depende casi exclusivamente de mutaciones en genes cromosómicos, la asociación de estas resistencias podría deberse a la transferencia conjunta de ambos mecanismos de resistencia a través de plásmidos (Martínez-Martínez et al. (1998) ya demostraron la transferencia de resistencia a fluorquinolonas a través de plásmidos) y también, probablemente, a la selección de aislados con ambos mecanismos de resistencia por el frecuente uso de betalactámicos y fluorquinolonas en un mismo contexto terapéutico, como es el tratamiento de las infecciones del tracto urinario. Desde 1997 a 2002 se ha producido un incremento constante del consumo extrahospitalario de fluorquinolonas del 20%, mientras que el consumo total extrahospitalario de antibióticos ha descendido un 9% en el mismo periodo (Oteo y Campos, 2004). Además a nivel intrahospitalario Neuhauser et al. (2003) señalan que el descenso de la sensibilidad a ciprofloxacino de un 86% en 1994 a un 76% en el año 2000 en aislados procedentes de UCI está significativamente asociado al incremento en el uso de fluorquinolonas. 5.6. Resultados obtenidos mediante el sistema WIDER para los antibióticos betalactámicos Al igual que se hizo con el sistema VITEK 2, a los 469 aislados se les realizó estudio de sensibilidad mediante el sistema WIDER como se describe en el apartado 3.2.3.2. Tras identificar las especies a través del sistema Api20E, la identificación se introdujo manualmente en el 5. Discusión 337 sistema WIDER y éste aportó el estudio de sensibilidad del microorganismo inoculado en los paneles MIC/ID GRAMNEGATIVOS REV.1 tras ensayar las distintas concentraciones de los antibióticos para cada aislado (tabla 22). El sistema WIDER emitió un informe para cada aislado clínico donde constaban la identificación de especie, las concentraciones críticas obtenidas in vitro para cada antibiótico ensayado, la categoría clínica correspondiente (sensible, intermedio o resistente) según el resultado obtenido para cada antibiótico, y la modificación de las categorías clínicas obtenidas in vitro una vez que el sistema realizó la interpretación del fenotipo de resistencia obtenido para cada grupo de antibióticos. De los 125 aislados productores de BLEEs por el método fenotípico de referencia, 102 fueron reconocidos también por el sistema WIDER (81,6%), que informó en todos ellos la posible presencia de una BLEE; sin embargo, en 23 de estos aislados (18,4%) el WIDER no detectó la presencia del enzima. De los 344 aislados no productores de BLEEs por el método de referencia, el WIDER informó como posible presencia de BLEE en 56 (16,3%), mientras que en 288 aislados no informó, por el fenotipo encontrado, dicha presencia. 5.6.1. Concentración mínima inhibitoria in vitro en los antibióticos betalactámicos Si analizamos los resultados in vitro obtenidos para los distintos antibióticos betalactámicos ensayados mediante el sistema WIDER, podemos observar que Amoxicilina se mostró poco activa en los dos grupos de aislados, productores y no productores de BLEEs (CMI 50 y CMI 90 > 16 µg/ml) Betalactamasas de espectro extendido 338 (tablas 78 y 81), si bien, en el primer grupo el 99% de los aislamientos tenían CMI > 16 µg/ml, y en el segundo el 18% de los aislados poseían una CMI ? 8 µg/ml (figuras 170 y 203). No hubo diferencias significativas entre los aislados productores de CTX-M9 y los productores de SHV. Los resultados son acordes con los mostrados por el sistema VITEK 2. La distribución de los resultados de CMI de amoxicilina-ácido clavulánico fue significativamente diferente entre los aislados productores de BLEEs y los no productores (figuras 171 y 204). Mientras que en los primeros el 70% presentó CMIs ? 8/4 µg/ml, en el segundo grupo sólo mostraron CMIs en el rango de sensibilidad el 41% de los aislados, es decir, los aislados productores de BLEEs se mostraron más sensibles a amoxicilina-ácido clavulánico (CMI 50 = 8/4 µg/ml y CMI 90 > 16/8 µg/ml) que los no productores (CMI 50 = 16/8 µg/ml y CMI 90 > 16/8 µg/ml) (tablas 78 y 81). No hubo diferencias significativas entre los aislados productores de CTX-M9 y los productores de SHV. Estos resultados fueron similares a los que este antibiótico presentó por el sistema VITEK 2. El comportamiento de piperacilina-tazobactam fue igual en los dos grupos de aislados, con CMI 50 < 16/4 µg/ml y CMI 90 > 64/4 µg/ml en ambos grupos, y tampoco hubo diferencias significativas entre los aislados productores de CTX-M9 y los productores de SHV (CMI 50 <16/4 µg/ml y CMI 90 > 64/4 µg/ml en ambos grupos). Sin embargo, vemos que con el sistema WIDER las CMIs de piperacilina-tazobactam fueron más elevadas que con el sistema VITEK 2. En el grupo de aislados productores de BLEEs el 33% presentaron, mediante el sistema WIDER, CMIs ? 32/4 µg/ml, mientras que, para este mismo grupo, el VITEK 2 sólo mostraba un 3% de los aislados con CMIs ? 32 µg/ml (figuras 172 y 81, respectivamente). En el grupo de no productores de la 5. Discusión 339 enzima ocurría algo parecido: el 35% de los aislados poseían una CMI ? 32/4 µg/ml según el WIDER, mientras que según el VITEK 2 dicho porcentaje fue del 2% (figuras 205 y 117, respectivamente). Cefalotina se mostró, al igual que amoxicilina, poco activa en los dos grupos de aislados (CMI 50 y CMI 90 > 8 µg/ml) (tablas 78 y 81), si bien en el primer grupo el 100% de los aislamientos tenían CMI > 8 µg/ml, y en el segundo el 72% (figuras 173 y 206). No hubo diferencias significativas entre los aislados productores de CTX-M9 y los productores de SHV. Los resultados son acordes con los mostrados por el sistema VITEK 2. El comportamiento de cefuroxima por el WIDER fue similar, también, al mostrado mediante el sistema VITEK 2, con CMIs elevadas en el grupo de aislados productores de BLEEs (CMI 50 y CMI 90 > 16 µg/ml), siendo significativamente mayores en el grupo de enzimas CTX- M9 que en el de SHV (figuras 185 y 196), y CMIs más bajas en el grupo de no productores (CMI 50 = 8 µg/ml y CMI 90 > 16 µg/ml) (tablas 78 y 81). Cefoxitina presentó diferencias entre los dos grupos de estudio, mostrándose ligeramente más activa en el grupo de aislados productores de BLEEs (CMI 50 = 16µg/ml y CMI 90 > 16 µg/ml) que en el de los no productores (CMI 50 > 16 µg/ml y CMI 90 > 16 µg/ml) (tablas 78 y 81). No hubo diferencias significativas entre los aislados productores de CTX-M9 y los productores de SHV. En los resultados obtenidos por el sistema WIDER podemos observar que cefoxitina se mostró menos activa que por el sistema VITEK 2, como podemos ver si comparamos las CMI 50 y CMI 90 en ambos casos para los dos grupos de aislados (tablas 58, 61, 78 y 81). El 50% de los aislados productores de BLEEs presentaron CMI >8 µg/ml por el sistema WIDER, frente al 15% por el sistema VITEK 2 (figuras 175 y 84, respectivamente). El 80% de los aislados no Betalactamasas de espectro extendido 340 productores de BLEEs presentaron CMI > 8 µg/ml por el sistema WIDER, frente al 26% por el sistema VITEK 2 (figuras 208 y 120, respectivamente). Esta sobrevaloración de resistencias a cefoxitina del sistema WIDER, respecto al VITEK 2, tuvo implicaciones diagnósticas. Como dijimos anteriormente, el sistema WIDER no detectó la presencia de BLEEs en 23 de los 125 aislados productores de estas enzimas. Pues bien, 22 de estos aislados presentaron CMIs ? 16 µg/ml para cefoxitina; sin embargo, en otros 41 aislados, a pesar de tener CMIs ? 16 µg/ml, el sistema sí fue capaz de identificar la presencia del enzima. Por lo tanto, pensamos que la incorrecta valoración de otros posibles mecanismos de resistencia que afecten a cefoxitina puede generar interpretaciones erróneas de la producción de BLEEs en los aislados clínicos ensayados por el sistema WIDER. Cefotaxima se mostró poco activa en los aislados productores de BLEEs (CMI 50 y CMI 90 > 8 µg/ml) (tabla 78) y activa entre los no productores (CMI 50 = 2 µg/ml y CMI 90 > 8 µg/ml) (tabla 81). El sistema WIDER no fue capaz de diferenciar la distinta capacidad hidrolítica sobre este antibiótico de las enzimas CTX-M9 y de las SHV (aunque hubo indicios de significación), pues presentaron una distribución de CMIs similares (el 100% de los aislados productores de CTX-M9 tenían una CMI > 8 µg/ml y el 95% de los productores de SHV) (figuras 187 y 198). Entre los aislados no productores de BLEEs el 12% presentó una CMI > 8 µg/ml, frente a los resultados del VITEK 2 en el que ningún aislado presentó estos valores de CMI (figuras 209 y 121, respectivamente). Ceftazidima también se mostró significativamente menos activa en los aislados productores de BLEEs (CMI 50 = 16 µg/ml y CMI 90 > 16 µg/ml) (tabla 78) que en los no productores (CMI 50 = 4 µg/ml y CMI 90 >16 µg/ml) (tabla 81). Con este antibiótico sí se observó claramente la 5. Discusión 341 menor actividad de las enzimas CTX-M9, con una CMI 50 inferior en este grupo respecto a los aislados productores de SHV (8 µg/ml frente a > 16 µg/ml) (tablas 79 y 80). Entre los aislados no productores de BLEEs el 19% presentó una CMI > 8 µg/ml, frente a los resultados del VITEK 2 en el que ningún aislado presentó estos valores de CMI (figuras 210 y 123, respectivamente). La reducción de la CMI de la combinación ceftazidima-ácido clavulánico, respecto a la CMI de ceftazidima sola, es un parámetro usado por el sistema WIDER para interpretar la posible presencia de BLEEs (TAZ no sensible, > 8 µg/ml, y TZ/C ? 1/4 µg/ml). Los cuatro grupos de estudio presentaron las mismas CMI 50 (< 1/4 µg/ml) y CMI 90 (8/4 µg/ml) (tablas 78 a 81) y presentaron distribuciones similares de los valores de CMI (el 88% de los aislados productores de BLEEs, el 85% de los aislados no productores, el 86% de los aislados productores de CTX- M9 y el 90% de los aislados productores de SHV presentaron una CMI <1/4 µg/ml), es decir, los cuatro grupos se mostraron básicamente sensibles a esta combinación antibiótica. Sin embargo, hay que considerar que, entre los aislados productores de BLEEs sólo 58 cumplieron las condiciones que para la combinación TAZ-TZ/C hemos expuesto y fueron identificados correctamente por el WIDER como productores de BLEEs, el resto, o presentaron CMIs para TAZ ? 8 µg/ml (55 aislados, de los que 32 fueron identificados por el WIDER como productores de BLEEs y 23 no lo fueron) o presentaron CMIs > 8 µg/ml pero con CMIs para TZ/C > 1/4 µg/ml (12 aislados que fueron identificados por el WIDER como productores de BLEEs). A su vez, de entre los 344 aislados no productores de BLEEs cumplieron las condiciones establecidas para la combinación TAZ-TZ/C para la determinación de la presencia de BLEEs 44 aislados, de los cuales 40 Betalactamasas de espectro extendido 342 fueron identificados erróneamente por el WIDER como productores de BLEEs. Al contrario de lo que ocurría con el sistema VITEK 2, los resultados in vitro para cefepime en el sistema WIDER son de escasa actividad sobre los aislados productores de BLEEs (CMI 50 y CMI 90 > 16 µg/ml) (tablas 78 a 80), con el 83% de los mismos con CMI > 8 µg/ml (figura 179), mientras que los aislados no productores de BLEEs se mostraron más sensibles (CMI 50 = 1 µg/ml y CMI 90 = 16 µg/ml) (tabla 81). Las enzimas CTX-M confieren resistencia de alto nivel no sólo a cefotaxima y a cefuroxima sino también a cefepime (Bradford, 2001) y eso explica un mayor porcentaje de CMIs > 8 µg/ml en el grupo de productores de CTX-M9 (93%) respecto a los de SHV (72%), lo que origina una distribución significativamente distinta de las CMIs en ambos grupos (figuras 190 y 201). Meropenem fue el único antibiótico betalactámico ensayado por el sistema WIDER que se mostró activo, y con CMIs muy bajas (CMI <4 µg/ml en el 99,2% de los aislados productores de BLEEs y en el 97,7% de los no productores) (figuras 180 y 213). Estos resultados son similares a los observados en el sistema VITEK 2. 5.6.2. Categorías clínicas para los antibióticos betalactámicos Cuando el sistema WIDER analiza los resultados de sensibilidad obtenidos in vitro para los distintos antibióticos es capaz de inferir qué mecanismo de resistencia, si lo hay, puede explicar ese comportamiento fenotípico, y modificar las categorías clínicas obtenidas para un antibiótico si el resultado no es coherente con el mecanismo de resistencia inferido para esa especie bacteriana, modificando siempre de 5. Discusión 343 sensible a resistente el ensayo. Por esta razón, cuando el sistema WIDER identifica una posible producción de BLEEs modifica las categorías clínicas de sensible a resistentes de todas las penicilinas, cefalosporinas de primera a cuarta generación, pero no modifica los resultados obtenidos para las combinaciones de betalactámicos con inhibidores de betalactamasas, cefoxitina, ni carbapenémicos. En las tablas 82 a 89 y en las figuras 214 a 221 quedan reflejadas las modificaciones que el sistema WIDER realizó de las categorías clínicas en los antibióticos betalactámicos ensayados. Así, los resultados in vitro para cefalotina fueron en los 125 aislados productores de BLEEs, resistentes, y se informaron como tales, no hubo que hacer ninguna modificación. El único aislado sensible a amoxicilina y también a cefuroxima entre los productores de BLEEs (aislado 246, productor de CTX-M9) no fue interpretado como resistente pues el sistema no fue capaz de detectar el enzima. Lo mismo ocurrió con un aislado con categoría clínica intermedia a cefuroxima (aislado 215, productor de SHV). En otros 5 de categoría intermedia pero en los que el sistema identificó la presencia de una BLEE (aislados 217, 224, 242, 267 y 280, productores todos ellos de SHV) el sistema WIDER modificó la categoría clínica y se informaron como resistentes. Cefotaxima fue informado como resistente tras las correcciones que el sistema realizó en los 3 aislados que presentaron CMIs dentro del rango de sensibilidad y que fueron correctamente identificados como productores de BLEEs (aislados 217, 267 y 280). El sistema modificó las categorías clínicas obtenidas in vitro para ceftazidima de todos aquellos aislados correctamente identificados como productores de BLEEs, pero no modificó dichas categorías en los 23 aislados incorrectamente detectados. Betalactamasas de espectro extendido 344 El WIDER no modificó las categorías clínicas de cefepime de 7 aislados productores de BLEEs, permaneciendo sensibles a este antibiótico; 5 de estos no fueron correctamente identificados como productores de BLEEs (aislados 54, 141, 215, 237 y 246), y, aunque 2 sí lo fueron, el sistema no modificó la categoría a resistente (aislados 224 y 231). No se modificaron los resultados obtenidos in vitro para amoxicilina-ácido clavulánico, piperacilina-tazobactam, cefoxitina ni meropenem, independientemente que el sistema detectase o no el enzima. Entre los aislados no productores de BLEEs el sistema WIDER modificó las categorías clínicas para 5 antibióticos, incrementando el total de aislamientos que se informaron como resistentes: 4 aislados para cefalotina, 44 para cefuroxima, 36 para cefotaxima, 20 para ceftazidima y 36 para cefepime. Todos ellos pertenecían al grupo de aislados no productores de BLEEs según el método fenotípico de referencia y que el sistema WIDER había identificado falsamente como productores de estas enzimas, de ahí que modificó las categorías clínicas a resistentes (figuras 220 y 221). 5.7. Evaluación de métodos fenotípicos Como hemos dicho en varias ocasiones, las BLEEs son uno de los mecanismos de resistencia más difíciles de detectar en los laboratorios de Microbiología Clínica. Este hecho se pudo poner de manifiesto en un estudio multicéntrico en el que participaron 130 laboratorios de América, Europa, Asia y África (Tenover et al., 2001). Se envió una cepa de K. pneumoniae productora de una enzima TEM-3 a los laboratorios participantes, que no conocían ningún dato sobre la sensibilidad de la bacteria, y se solicitó el correspondiente informe emitido por cada laboratorio. Ochenta y tres de los laboratorios (63,9%) usaron un método 5. Discusión 345 de difusión con disco y 47 (36,1%) usaron un método de determinación de CMI. Los laboratorios, por uno u otro procedimiento, ensayaron la sensibilidad del aislado a diferentes grupos de antibióticos, entre ellos a cefalosporinas de amplio espectro (ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona) y aztreonam, a excepción de 6 laboratorios, que no ensayaron ninguno de estos antibióticos. Siete de los laboratorios participantes (5,4%) informaron el aislado sensible a todas las cefalosporinas y al aztreonam. Noventa y seis de 105 laboratorios (91,4%) informaron resistente o intermedio a ceftazidima, 80 de 92 (86,9%) informaron resistente o intermedio a cefotaxima, 13 de 16 (81,2%) informaron resistente o intermedio a ceftriaxona. Aunque el 88% de los laboratorios informaron que el aislado era resistente, al menos, a una cefalosporina de amplio espectro, sólo dos de los 130 laboratorios (1,5%) informaron expresamente el aislado como ?productor de betalactamasas de espectro extendido?. Ningún laboratorio modificó los resultados de la categoría clínica de las cefalosporinas de ?sensible? a ?resistente?, como sugiere el NCCLS. En España se evaluó recientemente la capacidad de 52 laboratorios de Microbiología Clínica para detectar BLEEs mediante el uso de sistemas automatizados (VITEK 2, WIDER y MicroScan). Para ello a cada laboratorio se enviaron 6 cepas de enterobacterias productoras de BLEEs. Se obtuvieron los siguientes resultados para VITEK 2 y WIDER (Cantón et al., 2003): ? Cepa 1 (E. coli productor de TEM-27 y TEM-1): Fue detectada la presencia de BLEE en el 82% de los laboratorios que usaron VITEK 2 y en el 61% de los que usaron WIDER. ? Cepa 2 (E. coli productor de CTX-M9 y TEM-1): Fue detectada la presencia de BLEE en el 64% de los laboratorios que usaron VITEK 2 y en el 47% de los que usaron WIDER. Betalactamasas de espectro extendido 346 ? Cepa 3 (K. pneumoniae productor de SHV-5 y pérdida de OmpK35): Fue detectada la presencia de BLEE en el 82% de los laboratorios que usaron VITEK 2 y en el 61% de los que usaron WIDER. ? Cepa 4 (K. pneumoniae productor de SHV-5 y pérdida de OmpK35 y OmpK36): Fue detectada la presencia de BLEE en el 41% de los laboratorios que usaron VITEK 2 y en el 22% de los que usaron WIDER. ? Cepa 5 (E. cloacae productor de AmpC y CTX-M10): Fue detectada la presencia de BLEE en el 23% de los laboratorios que usaron VITEK 2 y en el 39% de los que usaron WIDER. ? Cepa 6 (E. cloacae hiperproductor de AmpC y CTX-M10): Fue detectada la presencia de BLEE en el 5% de los laboratorios que usaron VITEK 2 y en el 4% de los que usaron WIDER. Por tanto, los laboratorios de Microbiología Clínica deben disponer de métodos que ofrezcan la mejor capacidad de detección posible, conjuntamente a una buena relación coste-beneficio. Por esa razón, y en función de los resultados que hemos obtenido evaluando varios métodos fenotípicos para la detección de BLEEs en E. coli (especie bacteriana productora de BLEEs más representada en nuestro estudio), pretendemos conocer el método más rentable en nuestro medio para tal fin. En la tabla 91 se resumen los valores de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo de los diferentes métodos empleados para detectar la presencia de BLEEs en E. coli, y en la tabla 120 (ver más adelante) se resume el comportamiento en el laboratorio que, a nuestro entender, muestran los diferentes métodos usados. 5. Discusión 347 5.7.1. Métodos de difusión con disco y prueba de Epsilon El método A es cómodo, de fácil realización e interpretación, pero presenta el problema de utilizar discos que no son de uso habitual en un laboratorio de Microbiología Clínica, salvo para este cometido. Por otra parte, es el método de difusión con disco aconsejado por el NCCLS, y ha sido validado por diversos trabajos. M?Zali et al. (2000) refieren una sensibilidad para la combinación ceftazidima y ceftazidima-ácido clavulánico del 86% y para la combinación cefotaxima y cefotaxima-ácido clavulánico del 65,5%. Sin embargo, cuando considera el uso conjunto de las dos combinaciones, el método detecta hasta el 93% de los aislados productores de BLEEs. En los resultados expuestos por Carter et al. (2000) el uso de los discos de cefpodoxima y cefpodoxima-ácido clavulánico fue capaz de identificar, sin ningún falso negativo el total de aislamientos productores de BLEEs, con un 2% de falsos positivos; mientras que los discos de ceftazidima y ceftazidima-ácido clavulánico identificaron correctamente el 95,5% de los aislados productores de BLEEs sin obtener falsos positivos. La diferencia en los resultados obtenidos para la combinación ceftazidima y ceftazidima-ácido clavulánico entre estos dos estudios puede radicar, no sólo en los diferentes aislados estudiados, sino en que M?Zali et al. (2000) utilizaron el cociente entre los diámetros (consideraron que hay producción de BLEEs cuando el cociente entre el diámetro alrededor del disco de ceftazidima-ácido clavulánico y el que contiene sólo ceftazidima es ? 1,5) y Carter et al. (2000) usaron la diferencia entre diámetros para determinar la producción o no de una BLEE. Betalactamasas de espectro extendido 348 El método B también es un método cómodo, de fácil realización e interpretación. En la tabla 116 comparamos sensibilidad y especificidad obtenida en nuestro estudio con las obtenidas en otros trabajos. Tabla 116: Datos de sensibilidad y especificidad para el método de aproximación de discos en diferentes estudios Sensibilidad Especificidad Nuestro estudio 100% 100% Thomson y Sanders (1992)* 79% - Cormican et al. (1996) 87% 100% Sanders et al. (1996) 98,1% 99,4% Vercauteren et al. (1997)* 96,9% - Ho et al. (1998) 96% 100% *Estudios realizados en colecciones de cepas productoras de BLEEs caracterizadas genotípicamente Thomson y Sanders (1992) refieren una sensibilidad para el método de aproximación de discos del 79%, inferior a la encontrada por nosotros, sobre una colección de 32 cepas de E. coli y K. pneumoniae productoras de BLEEs. Para Cormican et al. (1996) la sensibilidad del método de aproximación de discos (valorando la sinergia sólo entre ceftazidima y ácido clavulánico en aislados productores de SHV y TEM) fue del 87% y la especificidad del 100%. Sanders et al. (1996) evaluaron el método de difusión con discos de cefotaxima, ceftazidima, aztreonam y ceftriaxona con un disco central de amoxicilina-ácido clavulánico en 119 aislados productores de BLEEs previamente caracterizados y 38 aislados no productores de BLEEs, obteniendo una sensibilidad del 98,1% y una especificidad del 99,4%, valores más parecidos a los obtenidos por nosotros. 5. Discusión 349 Vercauteren et al. (1997) realizan una ligera modificación del método de aproximación de discos consistente en el uso de discos de 30 µg de ceftazidima, ceftriaxona, cefepime y aztreonam dispuestos alrededor de un disco central de amoxicilina-ácido clavulánico con una composición 30/15 µg/ml (y no 20/15 µg/ml, como en el resto de los estudios y el que nosotros hemos realizado). Así refiere una sensibilidad para este método del 96,9%. Ho et al. (1998) obtuvieron una sensibilidad del 96% y una especificidad del 100%. Cuando evalúan por separado la sinergia entre cada uno de los antibióticos usados y ácido clavulánico, estas sensibilidades descienden al 93% para ceftazidima, 89% para aztreonam y 81% para cefotaxima. La baja capacidad de cefotaxima para detectar BLEEs en este estudio se puede deber a que las 81 cepas de E. coli y K. pneumoniae que se ensayaron eran productoras de enzimas TEM y SHV y ninguna era poseedora de una enzima CTX-M. Algunos de los elementos que pueden incidir en la sensibilidad del método son: la correcta colocación de los discos alrededor del disco central de amoxicilina-ácido clavulánico, una correcta distancia entre ellos (la disminución de la distancia desde 30 mm a 20 mm facilita la detección de la sinergia con ácido clavulánico), una lectura adecuada de la sinergia y el uso de cefpodoxima, un antibiótico muy sensible a la acción de las BLEEs. El E-test es fácil de realizar e interpretar, aunque pueden aparecer colonias dentro del halo que elevan la CMI y complican la interpretación (hecho que no ocurrió en nuestro estudio), además de requerir el uso de tiras exclusivas para el análisis. Aunque la tira CT/CTL fue capaz de detectar la presencia de BLEEs en todos los aislamientos, eso no implica que en todos los casos ocurra así. De hecho el fabricante recomienda el uso simultáneo de los E-test CT/CTL y TZ/TZL, aunque nosotros Betalactamasas de espectro extendido 350 tengamos muy buenos resultados sólo con CT/CTL. En la tabla 117 comparamos la sensibilidad y especificidad obtenida en nuestro estudio con las obtenidas en otros trabajos. Tabla 117: Datos de sensibilidad y especificidad para el E-test en diferentes estudios Sensibilidad Especificidad TZ/TZL CT/CTL En paralelo TZ/TZL CT/CTL En paralelo Nuestro estudio 49,6% 100% 100% 100% 100% 100% Nüesch-Inderbinen et al. (1996)* 52% - - - - - Cormican et al. (1996) 100% - - 100% - - Vercauteren et al. (1997)* 81% - - - - - Ho et al. (1998) 89% - - 100% - - Bolmström et al. (1999) 77% 91% 98% 93% 96% 99% Leverstein-van Hall et al. (2002) - - 100% - - 87% *Estudios realizados en colecciones de cepas productoras de BLEEs caracterizadas genotípicamente Nüesch-Inderbinen et al. (1996) estudiaron la capacidad del E-test TZ/TZL para detectar la presencia de enzimas SHV en 29 aislados productores de las mismas. Para ello consideran que un aislado es productor de BLEEs cuando el cociente entre la CMI de TZ y la CMI de TZL es >16. Obtienen un resultado de sensibilidad del 52%. Si hubiesen evaluado el método para un cociente entre CMIs >8, la sensibilidad hubiese aumentado hasta el 65,5%. Cormican et al. (1996) evaluaron la capacidad del E-test TZ/TZL para detectar BLEEs en 82 cepas productoras de BLEEs tipo TEM y SHV, pero considerando que una cepa era productora de BLEEs cuando el cociente entre las CMIs de TZ y TZL fue ? 5, y no a 8, como recomienda el fabricante. Ofrecen resultados de sensibilidad y especificidad para el E-test TZ/TZL del 100% en ambos casos, frente al 5. Discusión 351 87% de sensibilidad y 100% de especificidad que obtuvieron con la aproximación de discos Según Vercauteren et al. (1997) el E-test TZ/TZL detecta el 81% de los aislados clínicos productores de BLEEs cuando la presencia de las enzimas se valora con un cociente de CMIs ? 8, pero si siguen el criterio de Cormican et al. (1996) entonces la sensibilidad aumenta al 87%; resultados, en cualquier caso, superiores a los obtenidos por nosotros, y que pueden deberse a que en el estudio de Vercauteren et al. (1997) sólo hubo aislados productores de enzimas TEM y SHV, pero no CTX-M. Ho et al. (1998) dan una cifra de sensibilidad para el E-test TZ/TZL del 89%, un resultado muy inferior al que en este mismo estudio se obtuvo para el método de aproximación con discos (sensibilidad del 96%) usando el mismo antibiótico (ceftazidima) para estudiar los mismos aislados. La especificidad, sin embargo, fue del 100%. Bolmström et al. (1999) obtienen una sensibilidad del 77% y una especificidad del 93% para el E-test TZ/TZL y del 91% y 96%, respectivamente, para el E-test CT/CTL. Cuando ambas tiras se usan en paralelo la sensibilidad se incrementa hasta el 98%, con una especificidad del 99% en una colección de 337 asilados productores de BLEEs. Leverstein-van Hall et al. (2002) realizan un estudio sobre 17 cepas productoras y no productoras de BLEEs, caracterizadas genotípicamente y encuentran para el E-test TZ/TZL y CT/CTL una sensibilidad del 100% y una especificidad del 87%. Las técnicas de difusión con disco y E-test tienen algunas limitaciones, pues la hiperproducción de algunas betalactamasas cromosómicas o plasmídicas, o la existencia en el aislado de otros mecanismos de resistencia a betalactámicos, pueden favorecer la presencia de sinergia con ácido clavulánico dando lugar a falsos positivos en la detección de BLEEs. Además, estos métodos pueden generar falsos Betalactamasas de espectro extendido 352 positivos o negativos cuando son aplicados a algunas especies bacterianas en las que también se ha descrito producción de BLEEs. Así: 1. La hiperproducción de SHV-1 en E. coli y K. pneumoniae, causada por la presencia de múltiples copias del plásmido que las codifica, puede hacer que la CMI de ceftazidima suba a valores que pueden hacer sospechar una BLEE, especialmente por la ligera sinergia que puede aparecer entre ceftazidima y ácido clavulánico (Miró et al., 1998). En estos casos se incrementan las CMIs de penicilinas, asociaciones con inhibidores de betalactamasas, cefalosporinas de primera generación e incluso ceftazidima (4-8 µg/ml), mientras que afecta escasamente a las CMIs de cefoxitina, cefuroxima, cefotaxima, cefepime o aztreonam, que se mostrarán sensibles (Navarro et al., 2002). 2. La hiperproducción de la betalactamasa K1 de K. oxytoca confiere resistencia a cefuroxima, ceftriaxona, cefpodoxima, cefotaxima y aztreonam, pero no a ceftazidima, que permanece activa. Además, la hiperproducción de esta betalactamasa produce ampliación del halo con ácido clavulánico de cefuroxima, ceftriaxona, cefpodoxima, cefotaxima y aztreonam, nunca con ceftazidima (Carter et al., 2000; Navarro et al., 2002). Los aislados 215 y 283 de nuestro estudio, de la especie K. oxytoca, presentaron en los métodos de difusión con disco y en el E-test un fenotipo compatible con la producción de BLEEs y no de la enzima K1 (fueron resistentes a ceftazidima, cefotaxima, cefpodoxima y aztreonam y hubo sinergia en la asociación con ácido clavulánico en todos los casos). 3. La hiperproducción constitutiva de AmpC en E. coli puede elevar los valores de CMI de ceftazidima por encima de 1 µg/ml. Los aislados que sólo son productores de AmpC se mostrarán resistentes a ceftazidima, a cefpodoxima, y a cefotaxima en el 5. Discusión 353 método A y esa resistencia no será reversible en la asociación con ácido clavulánico, por lo que no se observará sinergia (Carter et al., 2000). 4. La presencia de una BLEE puede estar enmascarada por una enzima AmpC en el mismo aislado, que afectará la actividad de ácido clavulánico, dando lugar a falsos negativos en el estudio fenotípico (Bradford et al., 1997). Este problema es más frecuente en especies que habitualmente poseen una betalactamasa cromosómica inducible AmpC (Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp., Aeromonas spp., M. morganii, C. freundii, Hafnia alvei). Con estos microorganismos el ácido clavulánico puede actuar como inductor de altos niveles de AmpC e incrementar la resistencia del aislado a la combinación de la cefalosporina con ácido clavulánico, produciendo un falso negativo en los métodos de detección de BLEEs. Una posible solución es incluir en el ensayo fenotípico de detección de BLEEs en estas especies cefepime (Tzouvelekis et al., 1999), ya que la hiperproducción de AmpC no tiene efectos en la actividad de cefepime, siendo entonces éste el agente más eficaz en la detección de BLEEs cuando hay presencia conjunta de una betalactamasa tipo AmpC (Kenneth y Thomson, 2001). 5. La expresión de bajos niveles de OmpK35 (homóloga a OmpF de E. coli) junto a la presencia en el mismo aislado de enzimas TEM-1 y SHV-1, con niveles normales de OmpK36 (homóloga a OmpC de E. coli) puede ser responsable del incremento de CMI a cefotaxima, sin afectar a ceftazidima, en aislados de K. pneumoniae. La presencia de ácido clavulánico, que inhibe a las enzimas TEM-1 y SHV-1, puede reducir entonces la CMI para cefotaxima, dando lugar a sinergia entre ambos en la difusión con discos y a la reducción de CMIs en el E-test CT/CTL. En Betalactamasas de espectro extendido 354 definitiva, esta situación puede generar falsos positivos de BLEEs (Wu et al., 2001). 6. La hiperproducción de la betalactamasa cromosómica de P. vulgaris, P. penneri o C. diversus (cefuroximasa) que es inhibida por ácido clavulánico, puede dar una ampliación del halo con cefuroxima, cefotaxima y ceftriaxona (Navarro et al., 2002). La hiperproducción de esta enzima confiere resistencia a cefuroxima, ceftriaxona y cefotaxima, en cambio permanecen activas ceftazidima y aztreonam. 7. La producción de L2 de Stenotrophomonas maltophilia origina sinergia positiva con aztreonam debido a que la acción hidrolítica de esta enzima sobre aztreonam se ve inhibida por ácido clavulánico (Vila y Marco, 2002). Este fenómeno no debe confundirse con la presencia de una BLEE. Por último, otro problema que se puede plantear y es común a todos los métodos de difusión con disco y E-test, es el correcto almacenaje de los discos y tiras que contienen ácido clavulánico, ya que la pérdida de actividad de éste, por una conservación inadecuada, puede alterar los resultados, disminuyendo la sensibilidad de todos estos métodos. 5.7.2. Métodos automatizados En la tabla 118 exponemos algunas de las ventajas e inconvenientes que pueden tener los sistemas automatizados de lectura e interpretación del antibiograma (García, 2002). La principal ventaja de los sistemas automatizados de estudio de sensibilidad in vitro es la rapidez de los resultados desde el laboratorio. 5. Discusión 355 Al acortar el tiempo de respuesta en los estudios de sensibilidad in vitro se puede iniciar o cambiar más oportunamente la terapia antimicrobiana, lo que conlleva una reducción en los días de hospitalización y una reducción en el uso de antimicrobianos y en los costes totales. Por otro lado, el uso de los sistemas automatizados confiere una mejor estandarización y reproducibilidad de los resultados y una disminución de la carga de trabajo en los laboratorios, ya que los métodos de determinación de CMI (dilución en agar o dilución y microdilución en caldo), la prueba de Epsilon o los métodos de difusión con disco, son muy laboriosos cuando se realizan manualmente. Además, disponen de sistemas expertos que permiten utilizar algoritmos de informes. Estos sistemas permiten sospechar patrones fenotípicos de resistencia como betalactamasas de espectro extendido, entre otros, facilitan la obtención de estadísticas y permiten el análisis de las tendencias locales de resistencia. En los sistemas automatizados sobretodo, pero también en los procedimientos de difusión con disco, hay que considerar la importancia de un inóculo bacteriano adecuado para los ensayos de sensibilidad. Un inóculo bajo puede dar lugar a falsos negativos de BLEEs porque dan lugar a CMIs bajas, por debajo de las concentraciones establecidas por el NCCLS para la detección de estas enzimas (Queenan et al., 2004). Betalactamasas de espectro extendido 356 Tabla 118: Ventajas e inconvenientes de los sistemas automatizados de estudio de sensibilidad bacteriana (García, 2002) Ventajas Inconvenientes Rapidez en el informe de resultados (3-10 horas, inicio o cambio precoz del tratamiento y reducción de costos de hospitalización. Hay que disponer de una metodología de respaldo (habitualmente manual) por si falla el equipo Reproducibilidad intra e interlaboratorio Alto costo de paneles o tarjetas Disminución de la carga de trabajo en método que determinen CMI No existen normas NCCLS para sistemas automatizados Permite actualizaciones de las guías NCCLS Discrepancia con los métodos de referencia Permiten sospechar la presencia de BLEEs y otros mecanismos de resistencia bacterianos Los paneles o tarjetas están diseñados por el fabricante por lo que hay poca flexibilidad en los antibióticos ensayados Capacidad de almacenar y procesar la información facilitando la obtención de estadísticas Facilita el control en el uso de antimicrobianos El sistema VITEK 2 permite, junto a la identificación y estudio de la sensibilidad a otros antibióticos, conocer la presencia de BLEEs desde las primeras 4 horas de la inoculación de las tarjetas. Esto permite la caracterización rápida de estos aislados, de especial importancia entre las muestras hospitalarias. A esto hay que unir que el sistema evalúa la presencia de BLEEs sin una acción específica, es decir, junto al protocolo de identificación y sensibilidad a todos los antibióticos. Pero, además, dado el buen comportamiento del sistema VITEK 2 en nuestro estudio no sería, en principio, necesario confirmar los resultados obtenidos. En la tabla 119 comparamos los resultados de sensibilidad y especificidad que nosotros hallamos, con los encontrados en otros trabajos. 5. Discusión 357 Tabla 119: Datos de sensibilidad y especificidad para el sistema VITEK 2 en diferentes estudios Sensibilidad Especificidad Nuestro estudio 100% 95,8% Sanders et al. (2000)* 89% - Cantón et al. (2001)* 98,8% - Livermore et al. (2002)* 93% - Leverstein-van Hall et al. (2002) 100% 87% Sturemburg et al. (2003)* 85% - *Estudios realizados en colecciones de cepas productoras de BLEEs caracterizadas genotípicamente Sanders et al. (2000) obtuvieron una sensibilidad del 89% evaluando 36 aislados de las especies E. coli, K. pneumoniae y K. oxytoca productoras de BLEEs caracterizadas genotípicamente. En este estudio se afirma que el sistema no siempre discrimina entre un fenotipo BLEE, la presencia de un fenómeno de impermeabilidad y la producción de AmpC y sugiere la necesidad de una prueba específica para la detección de BLEEs en las tarjetas VITEK basado en la presencia y ausencia de ácido clavulánico. Cantón et al. (2001) evalúan la capacidad del sistema VITEK 2 para identificar la presencia de BLEEs en 86 aislados productores de estas enzimas (31 E. coli, 38 K. pneumoniae, 1 C. freundii, 10 Enterobacter spp., y 6 Salmonella spp.), obteniendo una sensibilidad del 98,8%. Cuando en este estudio nos referimos exclusivamente a las especies E. coli y K. pneumoniae, entonces la sensibilidad es del 100%. Livermore et al. (2002) obtienen una sensibilidad del 93% al evaluar el sistema VITEK 2 en 28 aislados de E. coli (26/28) productores de BLEEs tipo TEM y SHV. Cuando en el estudio se introducen otras especies como Klebsiella spp. (99 aislados), E. cloacae (6), Salmonella spp. (3) y Enterobacter gergoviae (1), la sensibilidad es del 92% (126/137). Betalactamasas de espectro extendido 358 Leverstein-van Hall et al. (2002) realizan un estudio sobre 17 cepas productoras y no productoras de BLEEs, caracterizadas genotípicamente y encuentran para el sistema VITEK 2 una sensibilidad del 100% y una especificidad del 87%. Sin embargo, cuando este estudio se amplía con 70 aislados clínicos la sensibilidad cae al 74% y la especificidad apenas cambia (85%), debido, según el autor, al alto número de resultados indeterminados por el sistema VITEK 2. Sturenburg et al. (2003) analizan el sistema VITEK 2 en 34 aislados de las especies E. coli y Klebsiella spp. productoras de BLEEs caracterizadas por PCR y obtienen una sensibilidad para el método automatizado del 85%. Uno de los problemas que plantean los métodos de difusión con disco y el E-test para la detección de BLEEs es el tiempo que se emplea en confirmar si el aislado es o no productor de la enzima. El primer día se obtiene el aislado sospechoso (en base a una sensibilidad disminuida a cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima, cefpodoxima y/o aztreonam) y se debe esperar un día más para conocer la sensibilidad a los discos de las cefalosporinas con el inhibidor de betalactamasas y confirmar la sospecha. Si el aislado no se informó, y ahora es productor del enzima, la terapia adecuada se ha retrasado durante un día, y si se informó como productor, y no lo es, se ha estado usando indebidamente una terapia (posiblemente un antibiótico carbapenémico). En aquellos laboratorios que utilicen el método automatizado VITEK 2 para identificación y estudio de sensibilidad de los microorganismos obtenidos en las muestras clínicas, y según nuestros resultados, podríamos estar reduciendo el tiempo del informe sobre un aislado, tanto positivo como negativo, referido a la producción de BLEEs. Esto es así porque el sistema VITEK 2 puede informar el resultado de una CMI aproximadamente entre las 6 y 10 horas de inoculado el microorganismo en las tarjetas correspondientes del sistema; este tiempo se reduce a 2 horas en caso de resistencia. Si 5. Discusión 359 dicha CMI es igual o superior a los límites establecidos por el NCCLS para identificar un aislado productor de BLEE, se puede ir ya, en ese momento informando al clínico de la limitación de uso de los antibióticos betalactámicos afectados. En relación a la capacidad del sistema WIDER para detectar BLEEs pensamos, en base a los resultados obtenidos (sensibilidad del 82,6%, especificidad del 84,5%, valor predictivo positivo del 68,3% y valor predictivo negativo del 92,3%), que éste no es un método apto para la detección de estas enzimas, tanto porque es incapaz de detectarlas en algunos aislados (que serían informados posiblemente como sensibles a algunas cefalosporinas de tercera generación pudiendo dar lugar a fallos terapéuticos), como por la necesidad de requerir un método de confirmación de los resultados positivos. Por otro lado, la necesidad de incubar las placas, una vez inoculadas con la suspensión bacteriana, a 37º C durante al menos 18 horas, retrasa el informe definitivo al clínico. Existen pocos estudios que hayan evaluado el sistema WIDER para la detección de enzimas tipo BLEEs. El estudio que Cantón et al. (2000) realizó sobre el WIDER no aporta valores de sensibilidad y especificidad del sistema pero obtiene un 92,3% de concordancia entre los valores de CMI de los diferentes antibióticos ensayados por el sistema WIDER y las CMIs obtenidas por microdilución, como método de referencia, al estudiar, tan sólo, 7 cepas productoras de BLEEs (1 E. coli, 1 C. freundii y 5 Enterobacter spp.). Este valor de concordancia entre un total de 328 combinaciones antibióticos-microorganismo es el más bajo obtenido en este estudio si lo comparamos con los obtenidos para otros grupos de aislados productores de otros mecanismos de resistencia distintos a las BLEEs. Tabla 120: Características de los métodos usados para la detección de BLEEs (original) Prueba ¿Requiere acción específica en el laboratorio? Interpretación Tiempo de obtención de resultados Ventajas Inconvenientes Método A Requiere la utilización de discos específicos. Necesita poner de manifiesto la sinergia con ácido clavulánico. 48 horas. Fácil interpretación de los resultados. Adaptado a los criterios NCCLS. No descarta otro mecanismo de resistencia simultáneo. Método B Requiere correcta colocación de los discos con antibióticos y control de la distancia entre ellos. Necesita poner de manifiesto la sinergia con ácido clavulánico. 48 horas. Fácil ejecución en el laboratorio. Precisión en la correcta lectura de los halos de inhibición. E-Test Requiere tiras específicas. Cociente entre las CMIs obtenidas. 48 horas. Informa de la CMI. Precisión en la correcta lectura de las CMIs. VITEK2 No. Se realiza dentro del trabajo habitual del laboratorio. Está automatizada por un sistema experto (AES) A partir de las 4 horas, aproximadamente. Interpretación automatizada y rapidez del resultado. Precio elevado que puede limitar su uso a los aislados hospitalarios. WIDER No. Se realiza dentro del trabajo habitual del laboratorio. Está automatizada por un sistema experto. 24 horas Interpretación automatizada. Precio elevado Menor capacidad de detección de BLEEs. 5. Discusión 361 5.8. Epidemiología Una vez evaluada la capacidad de los distintos métodos fenotípicos usados en nuestro estudio para detectar la presencia de BLEEs en enterobacterias de las especies E. coli, K. pneumoniae y K. oxytoca, y obtenidos los resultados sobre identificación bioquímica y molecular de las enzimas presentes en los aislados, es importante analizar qué características demográficas o epidemiológicas presentan estas betalactamasas en nuestro medio: 1. Distribución por especies bacterianas: De entre los aislados productores de BLEEs el 92% correspondieron a la especie E. coli, 6% a K. pneumoniae y 2% a K. oxytoca. De entre los aislados no productores de BLEEs el 82% fueron de la especie E. coli, el 12% de K. pneumoniae y el 6% de K. oxytoca (figuras 23 y 24). 2. Distribución por sexos: 69% de mujeres entre los aislados productores de BLEEs frente a 67% de este sexo entre los aislados no productores y 31% frente a 33% de varones en cada grupo (figuras 32 y 33). 3. Distribución por el origen de las muestras: El 74% de los aislados productores de BLEEs fueron de origen extrahospitalario frente al 77% de este mismo origen entre los aislados no productores. El 26% restante de los aislados productores de BLEEs procedían de muestras intrahospitalarias frente al 23% con esta misma procedencia en el otro grupo (figuras 38 y 40). La distribución de las muestras hospitalarias según el servicio solicitante queda reflejada en las tablas 37 y 38, donde podemos ver que los servicios de Pediatría, Medicina Interna y Cirugía General son los que más muestras aportaron en el estudio. Las muestras extrahospitalarias procedieron fundamentalmente de centros de Atención Primaria y de consultas hospitalarias (97,8%). Betalactamasas de espectro extendido 362 4. Distribución por tipo de muestras: Hubo un claro predominio de la orina entre los aislados, tanto productores (86,4%) como no productores de BLEEs (91,9%) (figuras 34 y 35) frente a exudados de origen quirúrgico, secreciones genitales y otras muestras. Este claro predominio de la orina se debe a que ésta es la muestra más frecuente recibida en nuestro laboratorio, la infección de orina es más frecuente en mujeres que en varones y E. coli es la enterobacteria más frecuentemente implicada en las ITUs. Así, el 65% de los aislados productores de BLEEs y este mismo porcentaje entre los no productores, procedieron de estudios de infección urinaria en mujeres (tablas 35 y 36). Teniendo en cuenta que la ITU es una de las causas más frecuentes de sepsis, nosotros consideramos que el estudio de la posible producción de BLEEs en este tipo de muestras es obligado. Al no haberse realizado una selección sistemática, aunque sí aleatoria, de los aislados clínicos, se decidió realizar un estudio prospectivo en el que se aislaron 744 enterobacterias entre los meses de Octubre y Noviembre de 2002 y cuyos resultados ya han quedado expuestos en el apartado 4.11. Cabe destacar que el 10,2% de los aislados pertenecientes a las especies en estudio presentaron una BLEE, predominando E. coli (92,6% entre los productores y 9,4% del total de estas especies), el origen extrahospitalario de las muestras (79,6% de los aislados productores) y la orina como muestra predominante (90,7% de los aislados productores de BLEEs). El 66,7% del total de aislados procedieron de mujeres. Como vemos, estos resultados obtenidos para un periodo de dos meses son acordes, en líneas generales, con los expuestos para el total de aislamientos productores de BLEEs de este estudio. En la tabla 121 comparamos los resultados de prevalencia de BLEEs que se han obtenido para distintos estudios realizados tanto en el ámbito nacional como en el internacional. 5. Discusión 363 Tabla 121: Resultados de prevalencia de BLEEs en diferentes trabajos Prevalencia Klebsiella spp. E. coli Comentarios Nuestro estudio 10,2% Referido a E. coli y Klebsiella spp. Martín et al. (2002) 1% 1,6% 1,2% en el total de enterobacterias Romero et al. (2004) 2,7% 5,2% Moreno et al. (2004) 6,9% 6,1% Yeste et al. (2002) 1,84% Referido sólo a muestras de orina Mirelis et al. (2003) 7,5% Entre muestras extrahospitalarias Hernández et al. (2003a) 0,5% 2,7% Saurina et al. (2000) 17,2% E. coli, K. pneumoniae y P. mirabilis De Champs et al. (2000) 3,2% En el total de enterobacterias Spanu et al. (2002) 6,3% En el total de enterobacterias Lewis et al. (1999) <10% E. coli y Klebsiella spp. En el Hospital Carlos Haya de Málaga aportan cifras de presencia de BLEEs en el 1,6% y 1% de los aislados de E. coli y K. pneumoniae, respectivamente, con 1,2% de prevalencia total de BLEEs entre enterobacterias (Martín et al., 2002). En el Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla se puede ver la evolución de los aislados a lo largo del tiempo. En términos de frecuencia, K. pneumoniae productor de BLEEs pasó de un 9,7% en 1995 a un 2,7% en 2003, mientras que E. coli productor de BLEEs se incrementó de un 0,3% a un 5,2% en el mismo periodo; además, mientras que K. pneumoniae aparece en forma de brotes intrahospitalarios, los aislamientos de E. coli se distribuyeron de forma homogénea, aumentando en los últimos años tanto a nivel intrahospitalario, como, sobretodo, a nivel extrahospitalario, y predominando en orinas tanto una como otra especie (Romero et al., 2004). Betalactamasas de espectro extendido 364 En el hospital Nuestra Señora de la Candelaria de Tenerife pasa algo similar, con cifras de frecuencia de 1% en 1999 para E. coli y 0% para Klebsiella spp. a cifras de 6,1% en 2003 para E. coli, 1,6% para K. pneumoniae o 5,3% de los aislados de K. oxytoca (Moreno et al., 2004). En el Hospital Virgen de las Nieves de Granada la prevalencia de BLEEs entre enterobacterias aisladas en muestras de orina es del 1,84% (todas de la especie E. coli), con un predominio del sexo femenino, en relación, también, al tipo de muestra donde se realizó el estudio y destacando en el mismo, como elemento diferenciador respecto al nuestro, que el porcentaje de aislados de enterobacterias productoras de BLEEs en el ámbito extrahospitalario es menor que en el intrahospitalario (Yeste et al., 2002). En Barcelona, en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau observan una prevalencia de E. coli productor de BLEEs entre muestras de pacientes extrahospitalarios del 7,5% en Octubre de 2002, mientras que en un estudio realizado entre los meses de Febrero a Mayo de 2001 la prevalencia fue del 2,1%, constatando, por tanto, un importante incremento de la presencia de estas enzimas (Mirelis et al., 2003). Comparando los datos de nuestro estudio prospectivo con los aportados por el grupo GEIH (Hernández et al., 2003a), el estudio más ambicioso en el ámbito nacional, podemos establecer: 1. Que al igual que el GEIH, la muestra donde predominantemente se aislaron las enterobacterias productoras de BLEEs fue la orina, con un 90,7% de aislamientos en nuestro estudio frente a un 66% y 43% para E. coli y K. pneumoniae respectivamente en el estudio del GEIH. 2. Que los porcentajes de aislados provenientes de muestras extra o intrahospitalarias, con relación al estudio GEIH son: 80% de extrahospitalarias y 20% de intrahospitalarias de E. coli, y 75% de extrahospitalarias y 25% de intrahospitalarias de K. pneumoniae en 5. Discusión 365 Granada; frente a un 51% de extrahospitalarias y 49% de intrahospitalarias de E. coli, y, 93% de intrahospitalarias y 7% de extrahospitalarias de K. pneumoniae en el estudio del GEIH. 3. Que en el área correspondiente al Hospital San Cecilio el 66,7% de los aislados provenían de muestras obtenidas de mujeres, mientras que en el estudio GEIH predominó el varón como fuente del microorganismo, con un 46% de los aislamientos de E. coli y un 66% de los de K. pneumoniae. 4. Los datos del trabajo indican, durante el periodo estudiado, una prevalencia global en España de E. coli y K. pneumoniae productores de BLEEs del 0,5% y el 2,7%, respectivamente. Sin embargo, en números absolutos, E. coli productor de BLEEs fue más frecuente que K. pneumoniae, tanto en aislamientos intrahospitalarios como extrahospitalarios. Probablemente este hecho se deba al aumento en el número de aislamientos de E. coli productor de BLEEs en muestras procedentes de la comunidad, que supusieron más de la mitad (51%). En el caso de E. coli productor de BLEEs los datos obtenidos en este estudio indican, por tanto, que en España este microorganismo se aisla principalmente en muestras de orina (66%), procedente de personas en un amplio rango de edad (0-93 años) y, en el 51% de los casos, en pacientes no hospitalizados. Por el contario, los datos de este estudio, en el cual el 93% de los aislamientos de K. pneumoniae productor de BLEEs proceden de muestras intrahospitalarias, indican que este microogrganismo sigue siendo un problema principalmente nosocomial y que los servicios donde se encuentran principalmente son las UCIs, tanto de adultos, como pediátricas. La distribución de las cifras de prevalencia de BLEEs en diferentes estudios se han referido casi siempre a aislados de origen intrahospitalario, consecuencia del estudio de brotes nosocomiales, y que habitualmente se ha considerado a éste como un mecanismo de Betalactamasas de espectro extendido 366 resistencia presente, sobretodo, en muestras de este origen. Entre los estudios internacionales Saurina et al. (2000) es el autor que aporta unas cifras mayores de prevalencia, con un 17,2% de los aislados de K. pneumoniae, E. coli y P. mirabilis en el área hospitalaria de Brooklyn (Nueva York). En el estudio francés de De Champs et al. (2000) (tabla 11) la prevalencia fue del 3,2%; en un estudio italiano fue del 6,3% (Spanu et al., 2002) (tabla 12), y en otro japonés, en aislados de E. coli y Klebsiella spp., fue inferior al 10% (Lewis et al., 1999). Desde el punto de vista molecular, en España se han descrito las siguientes betalactamasas de espectro extendido: TEM-4, TEM-12, TEM-24, TEM-27, TEM-54, TEM-70, SHV-2, SHV-5a, SHV-12, CTX- M1, CTX-M3, CTX-M7, CTX-M9, CTX-M10, CTX-M14 y CTX-M15. Mientras que, al principio, la mayoría de las BLEEs eran del tipo TEM o SHV (Baquero et al., 1988; Fernández-Rodríguez et al., 1992; Peña et al., 1998), actualmente las más frecuentes en España son las enzimas CTX-M, descritas especialmente en los últimos tres años, y siendo el tipo de BLEE más prevalente en E. coli (Sabaté et al., 2000; Oliver et al., 2001; Coque et al., 2002b; Hernández et al., 2003b). Las enzimas tipo CTX-M se están describiendo como las BLEEs más frecuentes no solo en nuestro país, sino también en otros países de nuestro entorno (Pagani et al., 2003), e incluso en países más alejados como Rusia, con un 35% de enzimas CTX-M (tipos 1 y 2) (Edelstein et al., 2003) o China (Munday et al., 2004). Además, en un estudio realizado en 12 hospitales de 7 países sobre 455 hemocultivos, de los cuales 73 eran por K. pneumoniae productor de BLEEs, el 67,1% de los aislados eran SHV, el 16,4% eran TEM y el 23,3% eran CTX-M; siendo esta última enzima la única que se describió en todos los países excepto Estados Unidos, y en Australia, Bélgica, Turkía y Sudáfrica, era la primera descripción de una BLEE de este tipo (Paterson et al., 2003). 5. Discusión 367 En hospitales de nuestro entorno se describe una situación similar. En el Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla, en un estudio sobre muestras extrahospitalarias de E. coli con predominio de la orina (76% de las muestras) hubo un 64% de aislados productores de CTX-M9 frente a un 18% para los aislados SHV y TEM (Rodríguez-Baño et al., 2004). En nuestro estudio el 55% de los aislados de E. coli de origen extrahospitalario producían una enzima CTX-M9, mientras que el 45% restante producía una enzima SHV. La diseminación de este tipo de BLEEs plantea ciertas dificultades para su detección, especialmente cuando se utiliza ceftazidima como único marcador (Sabaté et al., 2000; Sabaté et al., 2002), problema que, como hemos visto en los apartados 5.1.1., 5.1.2. y 5.3., en los que hemos analizado la capacidad de ceftazidima para detectar BLEEs tipo CTX-M, también a nosotros se nos ha planteado. Otro aspecto epidemiológico destacable es la creciente presencia de BLEEs en enterobacterias productoras de betalactamasas cromosómicas AmpC. En este sentido, la cepa productora de BLEE, para la cual se ha documentado una mayor diseminación, es una cepa de E. aerogenes productora de TEM-24 que ha sido la causa de brotes epidémicos en un gran número de hospitales de distintos países europeos, como Bélgica, Francia, Portugal y España (Cantón et al., 2002). 5.9. Estudio de clonalidad Entre los aislados hospitalarios obtenidos durante el periodo Octubre-Noviembre de 2002, en los que se realizó estudio de clonalidad por electroforesis en campo pulsado, no se observaron patrones compatibles con una posible diseminación clonal intrahospitalaria. Betalactamasas de espectro extendido 368 5.10. Opciones terapéuticas Los mayores porcentajes de sensibilidad de los aislados productores de BLEEs a antibióticos, obtenidos mediante el sistema VITEK 2, fueron a carbapenemas (100%) y amikacina (100%), seguidos de piperacilina-tazobactam (97,6%), amoxicilina-ácido clavulánico (85,6%), cefoxitina (84,8%), tobramicina (84%), gentamicina (83,2%), nitrofurantoína (70,4%), cotrimoxazol (49,6%), y por último las quinolonas, norfloxacino (34,4%), ciprofloxacino (32%) y ofloxacino (31,2%). Los estudios de sensibilidad realizadas sobre los aislados obtenidos en el estudio español del GEIH demostraron que los mayores porcentajes de sensibilidad de E. coli fueron a carbapenemas (100%), seguidos de amikacina (92%), piperacilina-tazobactam (77%), cefoxitina (75%), gentamicina (65%), amoxicilina-ácido clavulánico (40%), cotrimoxazol (38%) y ciprofloxacino (37%) (Hernández et al., 2002a); mientras que para los aislados de K. pneumoniae las mayores frecuencias de sensibilidad fueron a carbapenemas (100%), seguidos de amikacina (90%), cefoxitina (87%), ciprofloxacino (86%), piperacilina-tazobactam (64%), cotrimoxazol (51%), gentamicina (33%) y amoxicilina-ácido clavulánico (24%) (Hernández et al., 2002b). No es raro en la práctica clínica enfrentarse a un patrón de multirresistencia asociado a la producción de BLEEs en Enterobacteriaceae, lo que facilita la detección de estos microorganismos, pero limita enormemente las opciones terapéuticas. En la tabla 122 planteamos algunas de las posibilidades terapéuticas para los aislados productores de BLEEs 5. Discusión 369 Tabla 122: Opciones terapéuticas en las infecciones por bacterias productoras de BLEEs (Oliver y Cantón, 2004) Grupo Antibiótico Comentario Amoxicilina-ácido clavulánico Escasa experiencia en infección sistémica. Útil en infección urinaria. Piperacilina- tazobactam Variable en infección sistémica. Necesario estudio de sensibilidad. Betalactámico/ inhibidor de betalactamasas Cefalosporinas-ácido clavulánico Ausencia de formulaciones. Cefoxitina Desarrollo de mutantes de permeabilidad. Metoxi- betalactámicos Moxalactam Escasa experiencia. Efectos secundarios. Carbapenémicos Imipenem Meropenem Ertapenem Betalactámicos de elección. Hay que vigilar la aparición de resistencia en otros patógenos. Aminoglucósidos Necesario estudio de sensibilidad. Incremento de resistencias. Quinolonas Necesario estudio de sensibilidad. Incremento de resistencias. Fosfomicina No suelen existir resistencias cruzadas. Otros Nitrofurantoína No suelen existir resistencias cruzadas. Aunque las asociaciones con inhibidores de betalactamasas como amoxicilina-ácido clavulánico, piperacilina-tazobactam o ticarcilina- ácido clavulánico pueden ser útiles en el tratamiento de infecciones por estos microorganismos, uno de los problemas que podrían plantarse por Betalactamasas de espectro extendido 370 su uso es la posible aparición y selección de cepas tipo IRT, resistentes a estas combinaciones (Amyes y Miles, 1998). Amoxicilina-ácido clavulánico es una buena opción para el tratamiento de las infecciones del tracto urinario no complicadas por E. coli y Klebsiella spp. productoras de BLEEs, siempre y cuando sean sensibles, ya que es frecuente la resistencia a esta combinación por producción simultánea de otras betalactamasas, alteraciones de permeabilidad o, en menor medida, la hiperproducción de la propia BLEE. Por eso, puede ser una buena opción terapéutica en ITU en el medio extrahospitalario (Oliver y Cantón, 2004). No obstante, para el tratamiento de infecciones del tracto urinario no complicadas producidas por E. coli productores de BLEEs es posible recurrir al uso de antibióticos, casi ya olvidados, pero que presentan todavía una buena actividad y para los cuales no se encuentran habitualmente resistencias cruzadas en aislados con BLEE como son fosfomicina y nitrofurantoína (70,4% de aislados sensibles en nuestro estudio). Cefoxitina es frecuentemente activa y podría ser usada, pero este antibiótico desarrolla fácilmente resistencia por reducción de la permeabilidad, por lo que no se recomienda (Pangon et al., 1989; Martínez-Martínez et al., 1996). En los aislados productores de BLEEs cefepime debe ser informado resistente aunque in vitro sea sensible. Así lo recomienda el NCCLS, pues en aquellos casos en los que se ha usado cefepime, se ha producido fallo terapéutico (Paterson et al., 2001b). Existen pocos estudios que evalúen in vivo la capacidad de cefepime y piperacilina-tazobactam como fármacos útiles en el tratamiento de infecciones por microorganismos productores de BLEEs y normalmente están basados en una escasa experiencia clínica, como es el caso del estudio de Paterson et al. (2001b). Thomson y Moland (2001) 5. Discusión 371 evalúan la actividad in vitro de ocho antibióticos, entre ellos meropenem, cefepime y piperacilina-tazobactam, frente a 82 aislados de diferentes especies productoras de BLEEs solas y conjuntamente con otras betalactamasas. Para ello usan dos tipos de inóculo bacteriano, uno estándar (10 5 UFC/ml) y otro más elevado (10 7 UFC/ml). Se definió el efecto inóculo como la elevación de la CMI de cada antibiótico 8 o más veces cuando se ensayaba el antibiótico para el mayor de los inóculos bacterianos respecto al menor. Mientras que meropenem no mostró efecto inóculo y mantuvo iguales sus CMIs, cefepime sí lo mostró, pasando de mostrarse sensible en el 79% de los aislados con un inóculo estándar a tan sólo el 5% cuando el inóculo era mayor. Por su parte, piperacilina-tazobactam presentó un efecto inóculo intermedio entre los anteriores, pasando de un 95% de aislados sensibles con inóculo estándar a 58% cuando el inóculo era 10 7 UFC/ml. Estos resultados indican que, al menos, en aquellas situaciones clínicas caracterizadas por presentar un elevado inóculo bacteriano (endocarditis, meningitis, artritis sépticas, osteomielitis, abscesos...), el tratamiento con cefepime o piperacilina- tazobactam no será útil. Sin duda, los antibióticos carbapenémicos son el tratamiento de elección y, a veces, una de las escasas opciones terapéuticas para los aislados productores de BLEEs, consecuencia de la presencia de resistencias a otros grupos de antibióticos. Algunos estudios indican que en este sentido, el antibiótico carbapenémico más útil es ertapenem, con una CMI 90 de 0,06 µg/ml, frente a 0,5 µg/ml de imipenen, 16 µg/ml de cefepime o más de 128 µg/ml de piperacilina-tazobactam en aislados de K. pneumoniae productores de BLEEs (Livermore et al., 2001). Sin embargo, resulta cuando menos preocupante, que como muestra el estudio de Fernández et al. (2004), el 41,2% de los aislados de A. baumannii de los hospitales españoles sean resistentes al imipenem y el Betalactamasas de espectro extendido 372 49,8% a meropenem, alcanzando en algunos hospitales cifras del 60% (Gallego et al., 2004). Mientras que, según algunos estudios, la infección por A. baumannii (tanto sensible como resistente a carbapenemas) se relaciona con la estancia en UCIs y el uso previo de cefalosporinas de amplio espectro, sólo la infección por A. baumannii resistente a antibióticos carbapenémicos se relaciona con la presión selectiva previa por estos mismos antibióticos (Lee et al., 2004). Esto ha permitido que, en aquellos hospitales que han usado extensamente el uso de antibióticos carbapenémicos para el tratamiento de infecciones por BLEEs, como el hospital de Bellvitge (Barcelona), hayan aumentado las tasas de A. baumannii resistente a carbapenemas (Corbella et al., 2000). Cuando los microorganismos productores de BLEEs son sensibles a las fluorquinolonas, éstos son antibióticos útiles en su tratamiento (Karas et al., 1996). Sin embargo, estudios recientes demuestran que hasta un 55% de estos aislados son resistentes a fluorquinolonas (Lautenbach et al., 2001b), alcanzando nosotros cifras superiores al 65% como hemos visto. 6. CONCLUSIONES 6. Conclusiones 375 1. Destacamos en nuestro medio una elevada presencia de aislados clínicos de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Klebsiella oxytoca productores de betalactamasas de espectro extendido, fundamentalmente en la primera especie. Estos datos están de acuerdo con la tendencia ascendente de las cifras descritas para Escherichia coli en las diversas publicaciones nacionales e internacionales. 2. En nuestra serie se encontraron los tipos de betalactamasas de espectro extendido CTX-M9 y SHV con un predominio importante de la primera. Esta distribución es coincidente con los estudios realizados en otros centros hospitalarios del país en los que se ha descrito aumento de la presencia de enzimas del grupo CTX-M. 3. La mayor parte de las especies productoras de betalactamasas de espectro extendido se aislaron a partir de muestras de origen extrahospitalario, con un predominio de la orina y de enfermos de género femenino. Esto puede estar en relación con el importante uso de cefalosporinas orales de tercera generación en el medio extrahospitalario y la elevada frecuencia de las infecciones del tracto urinario en el sexo femenino. 4. Los estudios de clonalidad de los aislados hospitalarios de Escherichia coli del período Octubre-Noviembre de 2002 pusieron de manifiesto la ausencia de una distribución clonal, incluso entre aislados productores de la misma BLEE. 5. El estudio de la capacidad de detección fenotípica de los aislados productores de enzima por el sistema VITEK 2 puso de Betalactamasas de espectro extendido 376 manifiesto un buen comportamiento diagnóstico, que no hace necesario confirmar, por métodos estandarizados, los resultados obtenidos. Por el contrario, el sistema WIDER careció de un valor predictivo positivo adecuado, quizás debido a la falta de actualización en éste de los criterios que definen la presencia de las enzimas. 6. Entre los métodos no automatizados la prueba de Epsilon con cefotaxima y cefotaxima-ácido clavulánico mostró una alta rentabilidad diagnóstica. No obstante, ante la posibilidad de que pudieran aparecer enzimas tipo SHV y/o TEM con un perfil de substrato diferente al hallado en esta serie, pensamos que se deben usar simultáneamente con los E-test de ceftazidima y ceftazidima-ácido clavulánico. 7. El método de doble difusión con discos de cefalosporinas de tercera generación y aztreonam junto con una fuente de ácido clavulánico mostró una alta rentabilidad diagnóstica en la detección de aislados productores del enzima. Pensamos que puede constituir una alternativa en la práctica rutinaria del laboratorio clínico debido a que no requieren material específico. 8. En base a los resultados obtenidos pensamos, que, en la práctica clínica, la búsqueda de betalactamasas de espectro extendido en las especies Escherichia coli y Klebsiella spp. se debería realizar de forma rutinaria. En el caso de muestras procedentes de enfermos hospitalizados el sistema VITEK 2 constituye una opción válida por la precisión y rapidez en los resultados emitidos. Para muestras de origen comunitario la utilización de procedimientos con discos de cefalosporinas de tercera 6. Conclusiones 377 generación, con o sin aztreonam, junto con ácido clavulánico constituye una alternativa rentable para la detección de estas enzimas. 9. Nuestros aislados clínicos productores de enzimas mostraron una resistencia asociada importante a fluorquinolonas de primera y segunda generación, pero no a aminoglucósidos. También mostraron importante actividad meropenem, piperacilina- tazobactam y amoxicilina-ácido clavulánico, constituyendo todas éstas las alternativas terapéuticas usadas en el medio intra y extrahospitalario 7. BIBLIOGRAFÍA 7. Bibliografía 381 Abraham EP y Chain E. 1940. An enzyme from bacteria able to destroy penicillin. Nature 146:837. Afazal-Shah M, Woodford N y Livermore DM. 2001. Characterization of OXA-25, OXA-26 and OXA-27, molecular class D ?- lactamases associated with carbapenem resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents Chemother. 45:583-588. Ahmad M, Urban C, Mariano N, et al. 1999. Clinical characteristics and molecular epidemiology associated with imipenem-resistant Klebsiella pneumoniae. Clin. Infect. Dis. 29:352-355. Alonso R, Gerbaud G, Galimand M, et al. 2002. TEM-103/IRT-28 beta- lactamase, a new TEM variant produced by Escherichia coli BM4511. Antimicrob. Agents Chemother. 46:3627-3629. 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